副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失,并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善,现有的PTB疫苗保护效果不佳,并且干扰牛结核病的诊断,因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白,并对其免疫保护效果进行评价,为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因,分别构建5种重组质粒,在获得5种重组蛋白基础上,联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠,通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原;随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合,经皮下多点注射免疫小鼠,在二免...     

副结核分枝杆菌PanCD基因缺失株的构建及毒力评价

为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明：成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感...     

副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP＿2739的酶学特性研究

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP) GDSL脂肪酶家族蛋白MAP＿2739。为进一步分析MAP＿2739的酶学特性，本实验利用生物信息学网站和软件对MAP＿2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析，进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板，PCR扩增获得map＿2739目的基因约891 bp，克隆于表达载体p ET-22b中，构建重组质粒p ET-22b-map＿2739，转化大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后，利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果，并通过western blot鉴定。结果显示，获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP＿2739蛋白(rMAP＿2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体，通过ELISA方法检测，多抗血清效价为1:51 200。经差速离心法分离MAP参考株组分，利用该多克隆抗体为一抗，通过western blot检测，结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带，表明MAP＿2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)...     

结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

结核分枝杆菌(MTB) PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用，调节宿主炎症反应，有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用，本实验利用PCR扩增pe26基因片段，构建重组载体p AIN-PE26，转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms，经western blot鉴定结果显示，p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分，经western blot鉴定结果显示，r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定，结果显示，p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙，脊不规则且相对较高，褶皱不明显；p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞，通过q RT-PCR检测pe26转录水平，结果显示，H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞，分别通...