大鼠肌肉卫星细胞的分离、鉴定与诱导分化

肌肉卫星细胞是组织特异性干细胞,负责着骨骼肌的生长和再生.尽管发现卫星细胞的存在已经有50多年的历史了,但分离鉴定肌肉卫星细胞的方法仍然不稳定.本研究使用两步酶消化和差速贴壁相结合的方法分离大鼠(Rattus norve gicus)肌肉卫星细胞.免疫细胞化学染色显示,分离的大鼠肌肉卫星细胞高表达Desmin;通过RT-PCR鉴定所分离的细胞表达肌源性干细胞因子Myf5及Myod1;成肌诱导48h后,卫星细胞开始形成多核的肌管;成脂诱导1周后,细胞内开始出现脂滴,2周后充脂细胞明显增多.研究结果提示,分离的卫星细胞具有肌源性,有发育形成肌管和向成脂细胞分化的能力.     

牛肌肉卫星细胞向胰岛素分泌细胞的诱导转分化研究

肌肉卫星细胞是源自中胚层的肌源干细胞,具有增殖分化融合成肌管并形成肌细胞的能力.在体内条件下,肌肉卫星细胞不可能跨胚层分化为内胚层来源的胰腺细胞.本研究从牛(Bos taurus)胎儿肌肉中分离培养得到肌肉卫星细胞,并在体外条件下将其诱导成胰岛素分泌细胞.在诱导过程中,分析了与胰腺发育相关的胰十二指肠同源基因盒1基因(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)、神经原素3基因(neurogenin 3,NGN3)、淀粉酶基因(Amylase)和胰岛素基因(Insulin,INS)的动态表达情况.结果表明,PDX1作为决定胰腺分化发育和胰岛功能的主要调节基因,在诱导分化的第2天能够检测到其mRNA的表达,在第3天表达量达到了最大,第4天以后维持在较低水平.NGN3是内分泌细胞形成非常重要的转录因子,是能够将胰岛素分泌到胞外的关键基因,其mRNA在分化诱导的第3天开始表达,第4天达到最高水平,之后逐渐下降.Amylase是胰腺发育中细胞外分泌相关的基因,Amylase mRNA在第6天才开始表达,8d后达到最高.INS mRNA表达量在11～12 d最高,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)发现,诱导形成的胰腺细胞能够正常分泌胰岛素,培养液中胰岛素的浓度在诱导的11～12 d达到最高值.向培养液中添加葡萄糖后,可使细胞的胰岛素分泌量显著提高,说明诱导得到的细胞类似于成体胰岛的功能,其胰岛素分泌受外界葡萄糖浓度的调节.上述结果表明,肌肉卫星细胞可以被诱导转分化为胰岛素分泌细胞,并对培养环境中的葡萄糖刺激做出应答反应.本研究结果为进一步的研究和临床应用提供基础资料.     

Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达分布及对其成熟的影响

【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律,并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间（0-24 h）的牛卵母细胞,用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况,通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因（GenBank登录号：NM_001046332.1）的mRNA序列设计引物,并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点,用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区,将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应,得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后,将Cdc42WT（775 bp）和Cdc42T17N（775 bp）片段分别连接到pcDNA3.1（+）的多克隆位点区域,得到相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA,用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内,检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异,但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化：Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡（germinal vesicle,GV）期卵母细胞中很少出现,而在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）卵母细胞中出现得最多也最为明显;Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期（pro-metaphase Ⅰ,pMⅠ）,并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）逐渐增多;Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期（anaphase Ⅰ,AⅠ）到末期（telophaseⅠ,TⅠ）的卵母细胞中占有有很高比例,而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段,构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后,符合预期结果,即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N;③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对,符合预期结果,经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段,符合预期结果,即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA;④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比,注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低（P<0.05）。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白,而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用,而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。     

蒙古绵羊ghrelin cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank中报道的绵羊ghrelin序列设计一对特异性引物，以蒙古绵羊真胃组织中提取的总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出蒙古绵羊ghrelin的cDNA，并克隆到pTZ19载体中，经限制性内切酶谱和DNA序列测定，证实所克隆的蒙古绵羊ghrelin的cDNA为ghrelin的部分序列，因为用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果同已发表绵羊ghrelin序列进行对比，205个碱基中仅有1个碱基的差异，该差异不影响翻译后多肽的序列。该段cDNA包含由168个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码56个氨基酸残基的前原蒙古绵羊ghrelin。对蒙古绵羊ghrelin的研究将有助于进一步揭示其生理和病理功能，对反刍动物多种疾病过程的认识及防治策略具有深远意义。     

FAT1转基因系祖公牛选育及其扩繁研究

n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）是人体必需脂肪酸,对多种疾病有抑制作用。利用超数排卵与胚胎移植技术（superovulation and embryo transfer,MOET）对FAT1转基因牛进行了扩繁,并对F₁代牛进行了生长指标测定与遗传稳定性分析,在此基础上确定了系祖公牛ZK005;用ZK005的冻精经人工授精生产F₂代,并对其进行生长指标测定、遗传稳定性分析和血液生化指标检测。结果显示,原代牛的MOET扩繁效果良好,获得了8头FAT1基因阳性F₁代牛;F₁代牛生长指标与野生型牛无显著差异;外源基因稳定整合,n-3 PUFAs含量显著提高,n-6多不饱和脂肪酸/n-3多不饱和脂肪酸（n-6 polyunsaturated fatty acids/n-3 polyunsaturated fatty acids,n-6/n-3）比值显著降低;F₁代牛各组织中n-3 PUFAs含量显著提高,其中肌肉中提高最明显。从F₁代牛中选择备用系祖公牛ZK005,其精液冷冻后活力达40%,经人工输精获得F₂代牛12头,F₂代牛生长发育与血液生化指标整体上与野生型牛无显著差异。以上研究表明,利用转基因技术选育FAT1转基因牛,可培育富含n-3 PUFAs的转基因牛新品系（种）,提高牛肉、奶中n-3 PUFAs含量,且FAT1基因在F₁和F₂代牛中均能稳定有效表达,对转基因牛的健康无不利影响,可为人类提供更营养的食品。     

脱氧胆酸处理对大鼠肌肉卫星细胞的影响

肌肉卫星细胞是组织特异性干细胞,负责骨骼肌的生长和再生。尽管卫星细胞的发现已有50多年的历史,但肌肉卫星细胞的维持培养仍是一个难以解决的问题。本研究使用脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)处理肌肉卫星细胞,结果发现,50μmol/L脱氧胆酸能显著促进肌肉卫星细胞的增殖。Western blotting检测发现50μmol/L DCA能促进细胞内β-catenin表达水平的持续增加。处理6 d后的细胞仍然保持着肌肉卫星细胞的成肌能力。     

白绒山羊性控胚胎生产及移植应用研究初探

应用X性控冷冻精液对超排供体白绒山羊进行人工授精,生产性控胚胎并进行鲜胚移植。结果发现,①用性控冻精和鲜精输精的供体母羊,平均卵子回收数分别为13.3和12.5枚,其中性控冻精组受精卵比例为29.6%（55/186）,极显著低于鲜精组94.0%（281/299）的比例（P<0.01）;②性控胚胎和普通胚胎移植受体母羊产羔率分别为42.2% 和58.1% ,二者差异极显著（P<0.01）;③性控胚胎移植受体母羊所产羔羊雌性所占百分数为100%,极显著高于普通胚胎移植（P<0.01）。表明通过白绒山羊X、Y精子分离、人工授精生产性控胚胎,同时结合胚胎移植技术,可以达到按照生产实际中的意愿得到性别控制子代白绒山羊的目的。     

精子载体法制作转基因动物的可行性

精子载体法转基因由于具有简便易行、对卵原核无损伤等特点,而成为最具诱惑力的转基因方法之一近年来,已经通过该方法获得了多种转基因动物,从而对精子载体法制作转基因动物的可行性提供了证据.笔者对精子载体法的可行性、机制、提高转基因效率等方面作了简要综述.     

杂交F1代myostatin基因编辑肉牛的肉质特性分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因功能缺失能促进肌肉发育,提高产肉性能。为了解MSTN人工突变在肉牛杂交改良方面的作用,本试验分析了基因编辑鲁西黄牛F1代杂交牛的屠宰性状和不同部位肌肉的肉质特性。结果表明,试验组与对照组牛的胴体重分别为392.85±43.90kg和346.50±49.36kg,屠宰率分别为60.07±1.69%和54.63±2.08%,二者有显著性差异(P0.05)。与对照组相比,试验组牛的上脑、眼肌、米龙与腱子4个部位肌肉的pH值、剪切力和系水力没有显著差异(P0.05);试验组肌内脂肪含量均低于对照组(P0.05),脂肪酸组成没有发生显著改变(P0.05)。以上结果说明MSTN基因编辑牛的杂交F1代的产肉性显著提高,MSTN基因突变没有影响牛肉的pH值、嫩度和脂肪酸组成,但减少了F1代牛肌内脂肪的沉积。