信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽（简称endo）、蜂素信号肽（简称mel）及gp67信号肽（简称gp67）分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2⁷。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2⁷和1∶2⁴。亚型鉴定表明...