马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

 利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R-PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。     

转无毒基因马铃薯抗晚疫病的研究

晚疫病菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是危害全球马铃薯生产的严重病害.通过基因工程方法把外源基因导入植物体内以增强抗病性被证明是一条行之有效的途径.应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中.通过农杆菌或基因枪的介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株.本研究从病原细菌Pseudomonas syringae PV.tomato中获得的无毒基因avrD(0*93kb)和从病原真菌Phytophthora parasitica中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别与非专一性病原物诱导启动子Pill和BG组成含2个嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表达载体pYH144和pYHEt.通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯,其中用pYH144载体转化2个品种(克新1号,2号),用pYHEt载体转化3个品种(Desiree,克新2号,4号),通过组织培养分别获得潮霉素(HygromycinB)标记的转基因马铃薯试管苗.将转基因试管苗扩繁,应用马铃薯脱毒微型种薯生产技术获得转无毒基因微型薯,在温室(15～25℃和湿度高)条件下,观察转无毒基因马铃薯植株中对晚疫病菌自然感染的抗性.1998年和1999年(每年的3-5月)的温室试验初步表明用avrD和elicitin基因分别转化的转无毒基因马铃薯植株都具有较明显的对晚疫病菌侵染的抗性,大部分转基因植株不表现或表现轻微的感病症状,对照植株(未转化)则表现明显的感病症状.转基因植株生长正常,且在感染后期(恢复期)生长良好.对照植株在恢复期生长弱和缓慢.在获得较多数量的转无毒基因马铃薯微型种薯的时候,将进行人工接种晚疫病菌和田间种植试验,从中筛选出抗真菌病和细菌病的转基因马铃薯株系.     

兔出血症病毒的特性

从实验发病兔肝经过聚乙二醇葡聚糖硫酸钠(PEG-DS)二相分配法和蔗糖密度梯度离心提取和纯化兔出血症病毒。紫外测定呈典型的病毒紫外吸收曲线,260nm/280nm比值为1.33,1％的琼脂电泳检查呈一条带。负染电镜下观察,病毒无囊膜,二十面体立体对称,直径34—36nm,病毒子表面有直径5—6nm的壳粒32个。另外,电镜下还见到22nm左右的病毒颗粒。病毒在氯化铯中的浮密度为1.36—1.38g/cm~3,沉降系数为162S。琼脂糖电泳在pH8.3条件下,病毒子向阴极移动。     

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)东北分离物的核苷酸序列分析

自Gross等(1987)将马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid．，PSTVd)核苷酸序列公布以来，已有20种类病毒全序列被测定出来。类病毒大小一般在240～380核苷酸之间，长度相对稳定，同种类病毒在同一寄主上变化一般不超过10个核苷酸。一种类病毒在不同寄主上可导致出现较多突变，但一般均在15％突变范围之内。PSTVd根据在番茄上的表现症状可分为强系、弱系和中间株系。     

苹果锈果病(ASSD)类病毒的侵染性

 用机械接种的方法研究了苹果锈果病类病毒(ASSV)的侵染性.在嫁接时将接种原滴于砧木和接穗的切面上,用针刺切面,然后观察症状表现,所有接穗都取自同一株健康“国光”.用半提纯的ASSD—RNA—1和ASSD—RNA—2接种的,成活的3株中有2株发病;用提纯的ASSD—RNA—1和ASSD—RNA—2接种的,成活的3株中有1株发病;用病组织的澄清汁液接种的,成活的4株中有1株发病;用缓冲液模拟接种的健康对照成活的5株均未发病.发病苗木的症状为叶片卷曲,随后叶片从叶柄处断裂.从发病的,不发病的及健康对照的苗木茎部提取核酸,用双向及两次聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表现症状的4株均测出了ASSD—RNA—1,未发病的及用缓冲液模拟接种的健康对照均未检测出类病毒核酸带.结果表明ASSD—RNA—1可通过机械传播,为苹果锈果病的类病毒病原提供了又一次证据,也表明ASSD—RNA—1代表了能独立复制的苹果锈病类病毒.     

应用过氧化物同工酶(POD)鉴定马铃薯品种及纯度的研究初报

以不同品种马铃薯块茎、叶片和芽为研究对象,通过分析其过氧化物酶的同工酶谱的差异进行品种鉴定.马铃薯叶片和芽的同工酶谱分辨力高,不同品种差异显著,可作为品种鉴定和纯度分析的可靠的理论依据,而块茎可供分析的同工酶谱带少,效果不如用水溶性特异蛋白带鉴定方法好,只作为辅助鉴定,因此,过氧化物同工酶谱与块茎水溶性特异蛋白谱带互为补充作为用生化方法鉴定马铃薯品种和纯度的有效手段.     

TMV-L运动蛋白基因植物表达载体的构建及其与番茄Tm-22基因的互作

对含有烟草花叶病毒番茄株系(TMV-L)部分基因组cDNA的克隆进行缺失改造,得到了含有TMV-L运动蛋白(MP)基因的克隆.MP片段分别与组成型启动子CaMV35S和病原特异诱导型启动子CHS、PiⅡ和BG体外重组,构建成植物表达载体p35S-30K,pCHS-30K,pPiⅡ-30K和pBG-30K.通过农杆菌LBA4404介导,分别转化含Tm-22抗性基因的番茄品种Geneva 80.转化p35S-30K的基因工程植株在苗期观察到了部分坏死和黄化现象,初步证明TMV-L MP与Tm-22存在基因对基因的互作关系.诱导型启动子控制下的MP转基因番茄已得到部分潮霉素抗性愈伤组织,为进一步获得广谱高效抗病植株奠定了基础.     

蜜蜂蛹病病毒实验分析报告

应用差速离心和蔗糖密度梯度离心，从死亡的工蜂蛹中提取病毒，经电镜形态鉴定为大约２０ｎｍ直径的球形病毒。病毒核酸型为双链ＲＮＡ，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定病毒核酸为６组分，分子量别为０．９４４ｘ１０６、０．８６３ｘ１０６、０．８２５ｘ１０６、０．７５４ｘ１０６、０．７１３ｘ１０６、０．６７５ｘ１０６道尔顿，病毒蛋白外壳为１个组分，分子量为２５．８ｘ１０３道尔顿，沉降系数为５０．８Ｓ。研究结果确定，蜜蜂蛹病病毒（ＢＰＶ）为中国首次发现的一种蜜蜂病毒。     

蜜蜂蛹病病理及诊断的研究

对自然感染蜜蜂蛹病的蜂场调查，取样及症状观察，查明患病的蜜蜂蛹体色由白色变为灰白色，后期变为干枯状色，巢房盖被咬开，呈“白头蛹”状；感染试验表明，患病死亡的蜂蛹和病蜂群中的蜂王是传染来源；取自死亡工蜂蛹的头部，中肠组织和病蜂王卵巢组织作超薄病理切片，经电镜检测发现大量直径约２０毫微米的球型病毒粒子。电镜和免疫电镜诊断，均观察到大量的约２０毫微米的球型病毒粒子，此外，还对症状诊断，鉴别诊断和血清学诊     

类病毒的银染色检测

 类病毒是一种不含蛋白质的致病的小分子RNA。对于它的检测,目前采用的方法,其检测的灵敏度不高,一般只能达到0.5微克(0.5ug),往往会使含有极微量的病毒样品漏检。