犬瘟热病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

为了建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的方法,试验采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合的方法,根据CDV N基因序列中同源性相对较高的保守区设计一套标有生物素(biotin)的特异性引物,结合异硫氰酸(FITC)荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,对该方法的反应条件和反应体系进行优化,同时分析敏感性及特异性,最后检测临床应用情况。结果表明:试验成功构建CDV RT-LAMP-LFD方法,此方法的最佳反应条件为60℃反应60 min;最佳的反应体系为镁离子浓度12 mmol/L,甜菜碱浓度0. 2 mmol/L,Bst DNA聚合酶活性8 U,AMV酶活性5 U,外引物与环引物比例1∶2;最低检测下限为1×10~2个拷贝/m L,能够特异地检测出CDV的存在,犬细小病毒(CPV)等其他病毒均为阴性,可以检测出病犬口鼻腔黏液中的CDV。说明试验建立的CDV RT-LAMP-LFD检测方法特异性强,敏感性高,操作简单,可广泛应用。     

重组微线体MIC10的牛弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立牛弓形虫抗体间接ELISA检测方法,根据弓形虫MIC10基因序列设计合成引物,应用PCR技术扩增MIC10基因,将其克隆至pET-22b载体,构建重组质粒pET-22b-MIC10,将其转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western-blot分析表明,该重组蛋白能与弓形虫阳性血清发生特异性反应。重组蛋白经NiNTA纯化,应用牛弓形虫阳性、阴性血清建立了ELISA检测方法,抗原最佳包被质量浓度为5mg/L,二抗稀释倍数为1∶20 000,封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST溶液。该方法重复性好、特异性强、敏感性高,为牛弓形虫流行病学调查奠定基础。     

野生黑斑蛙皮肤抗菌肽快速分离、纯化方法的建立

正抗菌肽(AMPs)也被称为抗微生物肽,是分子质量比较小,可以抗细菌、病毒及原虫等微生物的一类小肽[1-3],其来源广泛,且具有耐热、耐酸碱及对微生物重复使用不产生耐药性等特点[4-5]。由于其特殊的性质和生物学活性,已成为新型抗菌药物的研究热点。将抗菌肽从成分复杂的样品中分离出来是困扰此类药物研究的关键问题之一。传统的分离方法复杂,采用蛋白质分离纯化的方法,如凝胶过滤色谱法[6-7]、离子交换色谱法[8-9]、制备型反相色谱法[10]等     

浮游细菌群落结构及其与网箱养殖鱼病害的关系

为了揭示深水网箱养殖区养殖过程中浮游细菌群落结构及其与网箱养殖鱼类细菌性病害的关系,采用Illumina测序技术对海南后水湾深水网箱养殖水样进行16S rRNA基因高通量测序。结果表明,检测到浮游细菌种群归属于36个门、56个纲、98个目、235个科、807个属,香农-威纳指数范围为2.47～4.5,说明该养殖区水体中浮游细菌具有丰富的多样性。变形菌门是主要优势门类,其次为拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门和蓝细菌门;主要类群为Cobetia属、弧菌属（Vibrio）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、盐单胞菌属（Halomonas）等,不同养殖期优势类群差异较大,其中休养期以Cobetia属、玫瑰变色菌属和嗜冷杆菌属为主;养殖初期以Cobetia属、假交替单胞菌属、Kushneria属和弧菌属为主;养殖中期优势类群为Cobetia属、盐单胞菌属、交替单胞菌属（Alteromonas）、弧菌属和假交替单胞菌属;养殖后期优势类群为GpIIa属和Cobetia属。潜在致病菌弧菌属相对丰度在不同养殖期差异较大,在养殖初期、中期含量较高,而在非养殖期和养殖后期含量较低,与网箱养殖卵形鲳鲹细菌性病害发病规律相吻合,表明由于弧菌引起的鱼类病害为养殖区的主要细菌性病害类型。