草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用

根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

省植物病理学会组织甘薯、花生、大豆线虫病考察

8月下旬,江苏省植物病理学会组织省农科院植保所、南京农学院植保系、省农林厅植保处的有关同志,对赣榆县的甘薯线虫病、花生根结线虫病及沛县的大豆胞囊线虫病进行了实地考察.六十年代前期,甘薯线虫病在赣榆县就有零星发生,1974年病田蔓延到8.5万亩,占全县甘薯种植面积的43%.1975年后,经不断试验和推广综合防治技术,茎线虫病的发生和为害基本得到控制.1982年全县发病面积下降到1.4万亩,仅占6.7%.综合防治措施包括种植抗病品种,水旱轮作或与非寄主作物轮作,薯块入窖高温处理,高剪苗和清除病薯,施用无茎线虫的土杂肥等,其中以前四项措施最为重要.     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。