海子水牛瘤胃微生物的宏基因组学分析

为系统探讨海子水牛瘤胃内的微生物组成及木质纤维素降解酶系,本试验利用基于高通量测序的宏基因组学技术对海子水牛(2.5岁左右,平均体重为493 kg)瘤胃液样本进行组学分析。结果表明,共获得了77 283 638条reads,并拼接出744 712个scaffold。经prodigal分析后,共预测出827 044个基因。通过基因注释发现海子水牛瘤胃中含有多种木质纤维素降解微生物,如生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)及栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)。此外,还发现有38 011个基因编码蛋白质具有木质纤维素降解酶活性,其中糖苷水解酶(GH)基因数量最多(17 877个),糖基转移酶(GT)(8 637个)、碳水化合物结合模块(CBM)(4 693个)和碳水化合物酯酶(CE)基因(4 214个)数量次之,多糖裂合酶(PL)(1 296个)和辅助氧化还原酶(AA)基因(934个)数量较少。在GH基因中,归属于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因较多,且编码蛋白质具有寡糖降解酶活性的基因数量最多。此外还发现了少量的纤维小体组分蛋白基因。结合其他物种肠胃宏基因组中GH基因比对分析,发现海子水牛瘤胃中的纤维素酶、半纤维素酶和分支降解酶比例与奶牛瘤胃较为接近。由此可见,海子水牛瘤胃内含有丰富的木质纤维素降解微生物及酶系,这将为筛选具有工业应用潜力的酶基因奠定理论基础。     

影响荷斯坦牛妊娠期长短的因素分析

妊娠期长短是影响奶牛繁殖性能以及牧场经济效益的重要性状之一。为探索影响荷斯坦奶牛妊娠期长短的因素,本文收集了江苏省某奶牛场2016年1月至2017年4月正常健康产犊的荷斯坦牛产犊记录共7 164条。用一般线性模型对犊牛性别、胎次、产犊季节、是否产双犊、犊牛初生重、产犊时母牛体况评分和是否使用性控精液对妊娠期长短的影响进行分析。结果表明:胎次、犊牛性别、产犊季节、产犊时母牛体况评分、犊牛初生重以及是否使用性控精液极显著影响妊娠期长短(P0.01),2胎母牛的妊娠天数显著高于1胎和3胎;产公犊牛母牛的妊娠期显著高于产母犊的奶牛;春季产犊的奶牛妊娠期最长,冬季则最短;产犊时母牛体况评分越高,其妊娠期越短;犊牛初生重越大,则母牛的妊娠期越长;采用性控精液的奶牛妊娠期显著短于非性控精液配种的奶牛;是否产双犊对妊娠期长短无显著性影响(P0.05)。该结果为控制荷斯坦奶牛妊娠期长短,提高其繁殖性能和经济效益等方面提供了科学依据。     

奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。     

中国荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突变对乳中脂肪酸组成的影响

【目的】FADS2是多不饱和脂肪酸合成中关键的限速酶之一,可催化食物中亚油酸(LNA,C18:2n6)合成γ-亚麻酸(GLA,C18:3n6)、二十碳五烯酸(EPA,C20:5n3)、二十二碳六烯酸(DHA,C22:6n3)等长链脂肪酸。试验旨在探讨中国荷斯坦牛FADS2基因3′端非编码区SNP突变对乳中脂肪酸含量的影响。【方法】随机选择20头无亲缘关系的中国荷斯坦牛样本,用直接测序列法检测FADS2基因3′端非编码区SNP突变位点。再以江苏某大型奶牛场551头中国荷斯坦牛为材料,用飞行时间质谱法对前期发现的2个SNP位点进行检测,同时利用最小二乘模型分析了SNP突变及其单倍型对乳中脂肪酸含量及其不饱和指数的影响。【结果】中国荷斯坦牛FADS2基因3′端非编码区存在3个SNP突变位点:c.1571 AG、c.2743 AG、c.2776 AG。c.1571 AG位点GG型为优势基因型,基因型频率为0.800,G为优势等位基因,基因频率为0.887。c.2776 AG位点AA为优势基因型,基因型频率为0.673,A为优势等位基因,基因频率为0.819。χ~2检验表明:c.2776 AG位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),而c.1571 AG位点基因型分布均偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。FADS2基因c.1571 AG位点与c.2776 AG位点间连锁不平衡系数r2为0.028,未达到显著水平(P0.05)。c.1571AG位点与c.2776 AG位点有3种单倍型,GA、GG和AA频率分别为0.705、0.181和0.114。多因素方差分析表明:FADS2-1571对C14:1含量、C14和C18不饱和指数的影响达到极显著水平(P0.01),对C18:0、SFA和MUFA含量的影响达到显著水平(P0.05)。GG型个体乳中C14:1含量、C14和C18不饱和指数显著高于AG型(P0.05)。FADS2-2776位点对C16:1含量、C16和C20不饱和指数的影响达到极显著水平(P0.01),对C14:1含量的影响达到显著水平(P0.05),GG型个体乳中C16:1含量、C16和C20不饱和指数显著高于AG型和AA型(P0.05)。同时,FDAS2-1571-2776单倍型对C16:1含量和C20不饱和指数的影响达到显著水平(P0.05),单倍型GG型个体乳中C16:1含量和C20不饱和指数显著高于GA型和AA型(P0.05)。【结论】FADS2基因3′端非编码区SNP突变对中国荷斯坦牛乳中脂肪酸组成有重要影响。在进一步验证其功能情况下,可作为影响中国荷斯坦奶牛乳脂肪酸组成的主效基因加以利用。     

荧光定量PCR检测原料乳中粘质沙雷氏菌

为建立检测原料乳中粘质沙雷氏菌(S.marcescens)定性定量的检测方法,本研究利用S. marcescens S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因片段设计1对特异性引物,设计并建立了S. marcescens luxS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法。结果显示,该方法可特异性检测粘质沙雷氏菌的存在,检测的最低限为6.9×10~2cfu/mL。与其他原料乳中常见的微生物均无交叉反应,比常规PCR的检测限(6.9×10~3cfu/mL)要广。对2015年11月~2016年1月长江下游地区8个牧场的原料乳进行检验,结果表明本检测方法具有较好的敏感性、特异性和实用性。