水貂出血性肺炎二联四价灭活疫苗的研制

为预防水貂出血性肺炎的发生,制备了水貂二联四价灭活疫苗,并进行了评估。对强致病性E、G和D型铜绿假单胞菌及H11基因型大肠杆菌进行了菌株的灭活,制备疫苗,对疫苗进行安全性检查、超剂量检查、最小免疫剂量确定、水貂攻毒保护试验及初步临床应用。结果表明,菌株灭活完全,平板上未见单一菌落出现,疫苗初步制备完成且安全检查试验中试管内未出现浑浊,超剂量检查试验中接种水貂未见不良反应。最小免疫剂量为0.5mL(5.0×108CFU)时对水貂起到完全保护,此时感染剂量为10 LD50个细菌,初步临床应用效果较好。本研究针对由铜绿假单胞菌和大肠杆菌感染引起的水貂出血性肺炎的预防和二联四价灭活疫苗的使用提供参考依据。     

大肠杆菌和绿脓杆菌混合感染引起的水貂出血性肺炎的鉴定

为了鉴定引起水貂发生出血性肺炎的病原体,试验采用病原分离鉴定、分离株16S rRNA扩增与序列分析、分离株对小鼠致病力试验、分离株血清分型鉴定、大肠杆菌H基因型鉴定、分离株药敏试验和分离株动物感染试验对来自山东省、辽宁省、河北省和黑龙江省的28份具有典型出血性肺炎症状死亡水貂的病料进行鉴定。结果表明:混合感染12例,单一病原菌感染16例,镜检可见短小的阴性杆菌和两端钝圆的阴性长杆菌; 16S rRNA扩增与序列分析共分离出22株绿脓杆菌和18株大肠杆菌,其中有4株对小鼠致死率达到50%以上,9株对小鼠致死率在10%～40%;从22株绿脓杆菌中共分离出8株G型、7株E型和7株D型,未检测出大肠杆菌血清型,大肠杆菌H基因型为H11;绿脓杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等6种药物敏感,大肠杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等10种药物均耐药;大肠杆菌和绿脓杆菌分离株均可导致水貂死亡并造成肺泡壁毛细血管瘀血、脾脏淋巴细胞数量减少、肺脏上皮细胞坏死、红髓内巨噬细胞数量增多等明显病理变化。说明目前引起水貂出血性肺炎的病原体已由传统的绿脓杆菌单一感染逐渐转变为大肠杆菌和绿脓杆菌的混合感染。     

牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测

为了制备牛分枝杆菌的单克隆抗体,本试验利用制备的原核表达的牛分枝杆菌重要抗原蛋白MPB70作为免疫原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术,经过5次亚克隆与筛选,取已免疫好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3500的作用下进行细胞融合。筛选得到了2株分泌抗牛分枝杆菌MPB70蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为Anti-B-MPB70:8和Anti-B-MPB70:12。采用间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行亲和常数检测、效价分析及亚类鉴定,通过SDS-PAGE凝胶试验对单克隆抗体进行纯度分析,并检测其浓度,通过Western blotting方法对单克隆抗体的反应特性进行鉴定。结果显示,纯化后的MPB70蛋白分子质量大小为20 ku,浓度为0.5 mg/mL。两株单克隆抗体的亲和常数分别为9.95×10~9和9.53×10~8;抗体效价分别为1∶102 400和1∶12 800;抗体亚类分别为IgG_(2b)和IgG_1,轻链类型均为κ型;纯度90%;浓度分别为3.0和2.2 mg/mL;且具有良好的反应特性。以上研究结果表明,本试验成功制备了抗MPB70蛋白单克隆抗体,可为牛结核病病原和抗体检测技术研究奠定基础。     

牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测

为了制备牛分枝杆菌的单克隆抗体,本试验利用制备的原核表达的牛分枝杆菌重要抗原蛋白MPB70作为免疫原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术,经过5次亚克隆与筛选,取已免疫好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3500的作用下进行细胞融合。筛选得到了2株分泌抗牛分枝杆菌MPB70蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为Anti-B-MPB70：8和Anti-B-MPB70：12。采用间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行亲和常数检测、效价分析及亚类鉴定,通过SDS-PAGE凝胶试验对单克隆抗体进行纯度分析,并检测其浓度,通过Western blotting方法对单克隆抗体的反应特性进行鉴定。结果显示,纯化后的MPB70蛋白分子质量大小为20 ku,浓度为0.5 mg/mL。两株单克隆抗体的亲和常数分别为9.95×10⁹和9.53×10⁸;抗体效价分别为1∶102 400和1∶12 800;抗体亚类分别为IgG_2b和IgG₁,轻链类型均为κ型;纯度>90%;浓度分别为3.0和2.2 mg/mL;且具有良好的反应特性。以上研究结果表明,本试验成功制备了抗MPB70蛋白单克隆抗体,可为牛结核病病原和抗体检测技术研究奠定基础。     

肌肉注射维生素ADE对育成牛血清生化指标的影响

本试验通过给育成牛肌肉注射维生素ADE注射液,检测血清生化相关指标变化情况,以深入了解肌肉注射维生素ADE对动物生理生化功能的影响,为维生素ADE注射液临床应用提供依据。选取公母兼有的9月龄育成牛30头;随机分为两组,对照组与试验组各15头。试验组肌内注射维生素ADE(1.5mL/50kg体重),对照组不作处理。在注射第0、1、3、5、7天采集两组牛各3头牛血样进行血清相关生化指标检测。结果:①试验组的血清丙二醛(MDA)含量随给药时间的推移呈下降趋势,并在注射第7天极显著低于对照组(P<0.01);②试验组总抗氧能力(T-AOC)逐渐上升,在注射后第7天极显著高于对照组(P<0.01);③试验组谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)呈现波动变化,但均高于对照组,GPT活性在注射后第7天与对照组相比差异显著(P<0.05),GOT在第1天与对照组相比差异极显著(P<0.01);④试验组碱性磷酸酶(ALP)含量升高,在第7天与对照差异极显著(P<0.01);⑤甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)两项指标,试验组与对照组相比,差异无统计学意义。结论:肌肉注射维生素ADE明显提高了育成牛血清总抗氧化能力,能够清除体内自由基,减少机体脂质过氧化的发生,从而减少脂质过氧化物的分解产物MDA的生成,减轻了对细胞和机体损伤;ALP分泌量增加,调节了育成牛钙磷代谢水平,使骨细胞代谢活跃,促进了骨骼生长;同时GPT、GOT活性升高,反映了育成牛的蛋白质代谢水平提高;所测得的TG、TC含量没有显著变化,说明维生素ADE对机体脂肪酸的合成和分解代谢无影响。     

水貂出血性肺炎大肠杆菌毒力基因测定和H基因分型

为了分离鉴定引起水貂出血性肺炎的大肠杆菌,并对其致病性、血清型和毒力基因进行鉴定.本研究主要通过细菌分离鉴定试验对具有典型肺炎症状的死亡水貂的病原体进行分离,利用16S rRNA对进行细菌鉴定,并通过PCR方法对分离细菌的血清型和毒力基因进行检测,分析分离菌对动物的致病性.结果显示:28例水貂肺炎病例中分离出8株大肠杆...