水貂肺炎二联苗制备及免疫效果评价

目前水貂肺炎主要以铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌为主,常于水貂换毛期时暴发性流行,且多呈混合感染。本文针对水貂肺炎面临的突出问题,根据国内外肺炎疫苗的研究进展与市面疫苗对水貂的保护情况,探索克雷伯荚膜多糖作为佐剂及其与铜绿假单胞菌制备二联苗对水貂保护。通过免疫小鼠产生抗体水平与特异性分泌细胞评价结果表明,荚膜多糖对铜绿假单胞菌抗原具有良好佐剂效用,但效果低于氢氧化铝佐剂。荚膜多糖是肺炎克雷伯良好抗原,能产生较高抗体。铜绿假单胞菌菌体疫苗与铜绿假单胞菌上清液疫苗抗体水平无显著差异。     

水貂源肺炎克雷伯杆菌分离、鉴定及疫苗潜能分析

水貂在夏季养殖时常出现出血性肺炎症状,病原大部分为铜绿假单胞菌。然而近10 a来采自河北、山东、辽宁等地水貂部分出血性肺炎病例中没有分离到铜绿假单胞菌,为探清病原,针对以上病料进行其他病原的分离鉴定。通过病料的细菌分离、常规鉴定,16S rRNA基因测序,动物回归试验、毒力试验、免疫原性试验及攻毒保护试验等,确定6株分离菌株有致病性,并被鉴定为肺炎克雷伯杆菌,分别命名为FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6,其中FY3为毒性最强的肺炎克雷伯氏菌（ZC1108株）。以该毒株对10月龄健康水貂进行肌肉注射,结果显示其致死率为100%（5/5）;以该菌株制备的灭活疫苗免疫水貂后攻毒保护率达100% （5/5）,试验水貂全部健活。表明肺炎克雷伯氏菌（ZC1108株）灭活疫苗免疫原性良好。     

仔猪大肠埃希氏菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的效力和安全试验

将带有K88、K99和987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株(C83549、C83644和C83710)和免疫原性良好的C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)菌株(C59-2、C59-37和C59-38)第10代基础种子制备的原液进行浓缩、甲醛溶液灭活和脱毒后,按抗原含量,加氢氧化铝胶制成3批二联灭活疫苗。经过对免疫怀孕母猪所产仔猪的攻毒测定,得到疫苗最小的免疫剂量为每头2mL,确定使用剂量为每头4mL。疫苗的免疫攻毒试验结果表明,疫苗在怀孕母猪中采用颈部肌肉注射进行免疫,二次免疫才能使仔猪通过吮吸初乳获得80%以上的被动免疫保护能力,与单苗具有相似的免疫保护力;单剂量、单剂量重复和超剂量的安全性试验结果显示,3批二联灭活疫苗不会引起母猪的全身不良反应和明显的局部反应,无流产,胎儿发育完全正常。     

草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵条件的优化

为优化铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗菌液发酵及灭活条件。通过单因素试验对铜绿假单胞菌JP802摇瓶培养温度、pH、接种量、转速4因素进行了优化筛选,采用正交试验法对发酵条件的参数进行了优化,并进行了验证试验及5 L发酵罐生长曲线;同时对铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗发酵菌液灭活条件进行优化。试验结果表明,铜绿假单胞菌JP802株最适发酵条件为28℃,pH7.5,以10%接种量,转速270 r/min,通气量4 L/min,发酵培养12～14 h。灭活条件优化结果表明在灭活温度为37℃条件下,福尔马林终浓度在0.40%,灭活48 h即能完全灭活。通过对发酵条件的优化,可以获得更高产量的铜绿假单胞菌JP802发酵菌液。     

重组铜绿假单胞菌外毒素A的原核表达和多克隆抗体制备及免疫保护功能分析

为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有很好的特异性;小鼠免疫保护试验结果表明,ETA对铜绿假单胞菌感染的保护率达50%,显著高于对照组的免疫保护率。用DNAman软件对ETA序列同源性进行分析,发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌,铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性;用MEGA软件对ETA的进化分析结果表明,不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌,据此可推测ETA免疫动物产生的特异性抗体可能为不同种类铜绿假单胞菌的感染提供交叉免疫保护。     

水貂出血性肺炎流行病学调查及绿脓杆菌疫苗研究进展

由绿脓杆菌引起的水貂出血性肺炎近几年在我国各地养殖场频繁发病。总结了该病发病情况和流行特点,概述了水貂出血性肺炎疫苗的研究进展。调查发现,我国水貂出血性肺炎的死亡率为6%～54%,以沿海气候潮湿的地区发病较多,全国流行的血清型以G、B、C型为主,与国外流行的主要血清型相同。目前用于防治水貂出血性肺炎的疫苗产品以灭活疫苗为主,外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和鞭毛等组分疫苗和基因工程疫苗在人医上尝试较多,兽医领域应用较少,但OMP疫苗和基因工程疫苗有提供共同保护性抗原的优点,在预防水貂出血性肺炎上有较好的应用前景。     

貂源铜绿假单胞菌耐药性及生物学特性

为了解貂源铜绿假单胞菌流行株基本特性,对分离的20株铜绿假单胞菌进行药物敏感性试验、血清型鉴定、ToxA基因检测、强毒株筛选及绝对致死量(LD_(100))测定。结果表明,铜绿假单胞菌分离株耐药现象比较严重,对氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林和四环素不敏感,对妥布霉素敏感率为95%;铜绿假单胞菌分离株的血清型为G型和B型,分别占85%和15%;20株铜绿假单胞菌均能检测出毒素基因ToxA;小鼠致死性试验表明,铜绿假单胞菌分离株之间毒力差异很大,少数菌株如ZHDL9、ZHDL6等均表现出较强的毒力。以菌株ZHDL9为代表株建立小鼠鼻腔感染模型,采用建立的感染模型测定得菌株ZHDL9对小鼠的LD_(100)为5×10~7 cfu。由此可见,分离的20株铜绿假单胞菌对临床常用抗生素耐药严重,对妥布霉素的敏感率为95%,提示该种抗生素可用于临床治疗水貂出血性肺炎,而菌株ZHDL9可作为生物制品研发的候选菌株。     

鸡大肠杆菌多价油乳剂灭活疫苗的研制及应用

筛选多株从山东各地分离的鸡源大肠杆菌菌株 ,复壮提纯后 ,通过增菌培养、甲醛灭活后制成灭活疫苗 ,经实验室检验合格后进行田间试验。 2年多 15 0万羽鸡的试验证明 ,该疫苗保护率 80 %以上 ,能有效地预防鸡大肠杆菌病的发生和流行     

藜麦种子总黄酮的提取及体外抑菌作用

采用96孔板微量法和牛津杯法研究藜麦种子总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌的抑制作用。结果表明,藜麦种子总黄酮对供试菌株的抑制效果由大到小顺序为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌,对金黄色葡萄球菌基本没有抑菌作用。最低抑菌浓度值分别为:大肠杆菌32 mg/m L、枯草芽孢杆菌64 mg/m L、白色念珠菌128 mg/m L、铜绿假单胞菌256 mg/m L、金黄色葡萄球菌512 mg/m L。说明藜麦种子总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和铜绿假单胞菌有抑菌作用,对金黄色葡萄球菌不敏感。     

鸭大肠杆菌自家铝胶灭活苗的制备及质量检验

[目的]为有效控制鸭大肠杆菌病的流行提供参考依据.[方法]利用分离自泰州某规模化养鸭场的大肠杆菌菌株TZY1作为菌种,制备鸭大肠杆菌铝胶灭活苗,并进行相应的质量检验.[结果]通过无菌检验、安全检验和动物保护力试验发现自制疫苗无外源性微生物污染,对雏鸭安全性好.对雏鸭的攻毒试验结果表明制备疫苗的免疫保护率达100％,该疫苗的免疫剂量为0.5ml.田间试验结果表明免疫保护率达95.1％.[结论]成功制备了鸭大肠杆菌铝胶灭活苗.     

臭氧对矿泉水中致病菌的杀灭效果

采用悬液定量杀菌和流动杀菌的方法,对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粪链球菌(Streptococcus faecium)和大肠杆菌(Escherichia coli)的臭氧消毒效果进行了研究。结果表明,悬液定量杀菌试验中,臭氧浓度0.36 mg/L,作用10 min后,铜绿假单胞菌存活率小于1.0%;臭氧浓度0.31 mg/L,作用3 min后,粪链球菌存活率小于0.1%;臭氧浓度在0.45 mg/L及以上,作用10 min后,大肠杆菌存活率在2.0%以下。流动杀菌试验中,臭氧浓度0.20~0.60 mg/L,作用3 min后,大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的存活率在0.01%以下,即杀灭率在99.99%以上。     

低功率X射线对生鲜肉污染微生物辐照的致死剂量

利用低功率的X光机,在3.08到18.48戈瑞(Gy)范围内对污染生鲜肉的微生物进行辐照,通过微生物存活率与辐照剂量的相关性分析,得出在此辐照条件下的D10值,并探讨对X射线辐照的敏感性。结果表明:环境污染菌大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌及其芽孢的D10值分别为5.41、5.00和23.81 Gy,致病菌金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌的D10值分别为5.35和6.45 Gy,腐败菌荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌及青霉孢子的D10值分别为3.62、4.39和16.39 Gy。供试菌株中蜡状芽孢杆菌芽孢和青霉孢子对辐照的抗性较强,荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌对辐照较为敏感。研究亮点:利用低功率的X光机,在Gy剂量范围内对污染生鲜肉的微生物进行辐照,对其杀菌效果进行一定地探索,得到实验中各供试菌株的辐照杀菌致死剂量,获得低功率低剂量X射线仍可对微生物产生一定杀菌效果的初步结论。     

二乙烯亚胺对水貂肠炎细小病毒灭活效果的研究

为研究二乙烯亚胺(BEI)对水貂肠炎细小病毒的灭活效果,采用BEI终浓度为0.003mol/L、0.002mol/L、0.001mol/L、0.0005mol/L,灭活温度为30℃,灭活时间为24h、48h、72h条件下,对水貂肠炎细小病毒进行灭活试验。通过F81细胞传代观察细胞病变和血凝试验检测灭活效果;用水貂检验BEI灭活水貂肠炎细小病毒所制疫苗的安全性,通过检测接种水貂的血凝抑制抗体,评价BEI灭活细小病毒所制疫苗的免疫效果,同时与甲醛灭活的疫苗进行免疫效果比较。结果表明,BEI终浓度0.002mol/L、30℃24h是灭活水貂肠炎细小病毒的适宜参数,BEI灭活工艺制备的水貂肠炎细小病毒灭活疫苗具有良好的安全性,BEI灭活工艺与甲醛灭活工艺的免疫抗体水平差异不显著(P0.05)。本研究为水貂肠炎细小病毒灭活工艺的研究提供了理论依据。     

仔猪红黄痢疫苗的最小免疫剂量、免疫持续期和保存期试验

用大肠杆菌K88、K99、987P菌株和C型产气荚膜梭菌制备成仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗(仔猪红黄痢疫苗),以不同剂量的疫苗免疫怀孕母猪,然后对其所产仔猪用发病剂量的相应菌株进行攻毒,同时将连续3批疫苗置2～8℃保存,分别于保存后的不同时间取样进行保存期试验。结果发现,用1.6mL以上剂量疫苗免疫组仔猪的攻毒保护率均在80%以上。通过对免疫母猪所产的1、4、7和10日龄仔猪进行攻毒,仔猪的攻毒保护率均不低于80%,说明疫苗免疫产生期为仔猪吸食初乳后24h内,仔猪被动免疫持续期为7d以上。疫苗保存期检测结果显示,疫苗保存27个月后,疫苗的性状检验合格,对怀孕母猪安全,疫苗免疫母猪所产仔猪攻毒保护率均不低于80%。因此,确定疫苗的最小免疫剂量为1.6mL,仔猪被动免疫持续期为7d以上,疫苗保存期为2～8℃保存24个月。     

规模化水貂场中多种病毒和细菌感染状况的PCR调查研究

当前水貂场存在多种病毒、细菌感染的情况,导致众多病原体混合感染、潜伏感染,临床上往往呈现慢性经过,并不表现出典型症状,给水貂养殖产业带来巨大经济损失。为了了解目前规模化水貂养殖场疫病感染情况,研究人员从2015年6月~2015年9月,对内蒙古的某个规模化貂场的所有仔貂进行了随机采样,通过PCR方法,分别对诺如病毒(Norovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、腺病毒(Adenovirus)、细小病毒(Parvovirus)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、小肠耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、气单胞菌属(Aeromonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)进行检测。结果显示,在192个粪便样品DNA中,气单胞菌属阳性样本16个(8.30%)、产气荚膜梭菌阳性样本11个(5.73%)、沙门氏菌属阳性样本38个(19.79%)、志贺氏菌属阳性样本6个(3.13%)、铜绿假单胞阳性样本1个(0.52%)、轮状病毒阳性样本2个(1.04%)。对疫病防控意义较大的铜绿假单胞菌PCR产物进行了序列测定和系统发育树分析,结果显示,该菌株与Gen Bank其他铜绿假单胞菌距离较远,显示以水貂为宿主的铜绿假单胞菌有着独特的拓扑分类地位。     

蝇蛆抗菌肽粗提物对铜绿假单胞菌毒力因子绿脓菌素（PCN）合成的影响

【目的】研究蝇蛆抗菌肽粗提物对铜绿假单胞菌毒力因子绿脓菌素(PCN)的影响。【方法】通过热处理和分级醇沉等方法得到蝇蛆抗菌肽粗提物,得率11%,制成25μg·μl~(-1)的母液,进一步研究不同浓度蝇蛆抗菌肽粗提液体对铜绿假单胞菌模式菌株PAO1和临床分离菌株PCN合成的影响。【结果】当浓度大于0.5μg·μl~(-1)时,蝇蛆抗菌肽粗提液对PAO1的PCN的合成产生了显著的抑制作用。临床分离的铜绿假单胞菌菌株也有类似的结果。【结论】低浓度(非致死剂量的)蝇蛆抗菌肽粗提物对铜绿假单胞菌毒力因子PCN具有显著抑制作用。     

水貂出血性肺炎多价灭活疫苗研制成功

水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎,是由绿脓杆菌引起水貂的一种急性传染病。该病主要发生在每年9—10月份水貂换毛季节,以出血性肺炎、急性死亡为特征,死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状,死后剖检可见整个肺叶弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发生,是危害水貂养殖业的重要传染病。     

兰香草沐浴盐抑菌作用研究

目的:考察兰香草挥发油及其沐浴盐对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的抑菌效果。方法:采用牛津杯法,考察兰香草挥发油及沐浴盐对4种菌的抑制效果,同时确定最低抑菌浓度(MIC)值。结果:兰香草挥发油对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,表皮葡萄球菌均具有不同程度的抑制作用,最小抑菌浓度分别为2.325 mg·g~(-1)、37.2 mg·g~(-1)、37.2 mg·g~(-1)和2.325 mg·g~(-1)。兰香草沐浴盐对4种菌的最小抑菌浓度为0.0625 mg·g~(-1)、0.1125 mg·g~(-1)、0.0625 mg·g~(-1)和0.1125 mg·g~(-1)。结论:兰香草挥发油及其沐浴盐对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌均有较好的抑制效果,其中对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌)的抑制效果高于革兰氏阴性菌(大肠杆菌,铜绿假单胞菌)。     

铜绿假单胞菌F_(190—342)-I_(21—83)基因的克隆及其融合蛋白的原核表达

为了研究铜绿假单胞菌外膜蛋白F和I的重要表位,根据已公布的F和I基因序列设计2对特异性引物,以分离的水貂源铜绿假单胞菌ZHDL9基因组为模板,扩增重要的表位基因F_(190—342)(F1)和I_(21—83)(I2),并对得到的2段基因序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增所得F1和I2两段基因序列高度保守,不存在核苷酸的插入和缺失;通过融合PCR技术将得到的F1基因和I2基因无缝连接,得到651 bp的融合基因F1I2。将融合基因F1I2克隆至原核表达载体p ET-28a,成功构建了融合表达质粒p ET-28a-F1I2;将pET-28a-F1I2转化大肠杆菌BL21 (DE3),成功构建重组菌株BL21(pET-28a-F1I2),并对重组菌株进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测表明,成功表达了融合蛋白F1I2,且融合蛋白能够被His镍柱纯化; Western Blotting检测表明,表达的融合蛋白F1I2与铜绿假单胞菌ZHDL9菌株感染的水貂血清具有较好的反应原性。     

规模化猪场大肠杆菌多价灭活苗的免疫试验

[目的]为减少大肠杆菌给规模化猪场造成的经济损失提供理论依据。[方法]用湖北省3个规模化猪场分离的致病性大肠杆菌O抗原优势血清型菌株,制备成3种自制多价灭活苗,分别于产前30、15d对30头妊娠母猪进行免疫保护试验。[结果]自制大肠杆菌多价灭活苗的甲醛含量为0.15%,符合质量标准。使用该苗进行免疫后,仔猪的平均发病率为5.8%,比对照组降低了40.8%。该疫苗免疫保护效果理想,平均保护率为87.5%。该疫苗较好地预防了仔猪黄痢、白痢的发生,极大地提高了仔猪成活率。[结论]在实际生产中,应定期从发病猪群中分离大肠杆菌菌株,根据分离结果不断调整灭活苗中的优势菌株。