重庆地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定

为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫溪、巫山地区玉米地里的草地贪夜蛾为材料,运用传统培养方法分离了其肠道优势细菌,并基于16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定,共获得了30个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,可归于5个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)以及气单胞菌属(Aeromonas);其中,克雷伯氏菌属(Klebsiella)的丰度最高,占所有分离菌株的63%;假单胞属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)菌株仅在巫山地区分离得到,气单胞菌属(Aeromonas)仅在巫溪地区分离得到.实验确定了入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类及丰度,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

虾肝肠胞虫水通道蛋白基因 EHP00_492 的克隆与表达特征分析

【目的】克隆虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）水通道蛋白编码基因 EHP00_492,分析其在 EHP 成熟孢子中的表达特征,为研究 EHP 水通道蛋白的功能提供理论基础。【方法】以虾肝肠胞虫为材料,克隆获得完整的 EHP00_492 基因,对其进行序列特征分析,构建 pCold-TF-EHP00_492 重组表达载体,转化至大肠杆菌中异源表达重组蛋白,制备兔多克隆抗体。利用蛋白免疫印迹实验和间接免疫荧光实验分析 EHP00_492 在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征。 【结果】 EHP00_492 的编码基因全长 729 bp,由 242 个氨基酸组成,富含亮氨酸,预测分子量为 25 kD,无信号肽,含有 6 个跨膜结构域,具有 MIP 蛋白家族结构域和 2 个水通道蛋白保守的 NPA/G 基序。此外,EHP00_492 与其他微孢子虫水通道蛋白序列同源性较高,系统进化树分析结果显示,EHP00_492 与毕氏肠胞虫 EBI_27080 蛋白亲缘关系最近。AlphaFold 分析发现,EHP00_492与已鉴定的家蚕微孢子虫水通道蛋白 NbAQP 和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白 EcAQP 的蛋白质三维结构高度相似,推测 EHP00_492 是一个潜在的水通道蛋白。蛋白免疫印迹结果显示,EHP00_492 蛋白在 EHP 成熟孢子中有表达,分子量为 21 kD。亚细胞定位分析结果显示,EHP00_492 蛋白定位于 EHP 成熟孢子的孢壁上。【结论】初步明确了 EHP00_492 蛋白的序列特征、结构特征及其与其他微孢子虫水通道蛋白的亲缘关系,以及其在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征,可为进一步研究 EHP 水通道蛋白的功能提供基础。     

云南地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离及鉴定

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)自2019年1月入侵中国以来,现已蔓延至全国25个省份.为了解草地贪夜蛾的肠道微生物的组成,近期该课题组在云南蒙自地区的玉米地采集了草地贪夜蛾幼虫及成虫,通过分离培养结合16S rDNA测序鉴定其肠道细菌分离株的种属.在幼虫肠道中分离到32个细菌分离株,通过16S rDNA序列同源聚类可归为4个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)和摩根菌属(Morganella),其中克雷伯氏菌属(Klebsiella)丰度最高,为53.1%;在成虫肠道中分离到16个细菌分离株归为5个属,分别为不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter),其中不动杆菌丰度最高,为56.0%.该研究首次对入侵中国的草地贪夜蛾成虫肠道细菌进行分离鉴定,为后续研究草地贪夜蛾生物学适应性等重要问题奠定了基础.     

家蚕微孢子虫极管蛋白2（NbPTP2）的表达、纯化和定位特征

【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）极管蛋白2（NbPTP2）,分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验（IFA）分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。     

设施内杏梅、李及杏远缘杂交试验

试验以设施内杏梅、李及杏等3种核果类果树为试材,进行了远缘杂交试验.研究结果表明:①母本的不同花期授粉,坐果率差异很大,铃铛花期授粉坐果率显著地高于初花期授粉坐果率.②不同杂交组合的坐果率差异显著,在同一母本(杏梅)的杂交组合中,以金太阳杏作父本的杂交组合坐果率最高,为23.8%.以平顶香李作父本的杂交组合坐果率最低,为7.1%.③杏(♂)×李(♀)组合虽然杂交亲和性较高,但杂种败育率也很高.杏(♂)×杏梅(♀)组合虽然杂交亲和性较低,但杂种败育率也很低.     

典型电镀场地含氟重金属污染土壤固化/稳定化技术研究与工程应用

以电镀场地重金属(主要污染物为六价铬、镍)含氟复合污染土壤为研究对象,选择硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)、多硫化钙(CaS_x)、氢氧化钙[Ca(OH)₂]、水泥、海泡石等5种固化/稳定化材料,开展修复技术研究及工程应用实施。研究结果表明:(1)单独添加Na₂S₂O₃和CaS_x对六价铬的去除率均达到100%,单独添加1.5%Ca(OH)₂对镍和氟化物的去除率为93.3%和12.3%;(2)低浓度的Na₂S₂O₃(0.2%)和Ca(OH)₂(2%)复配对六价铬、镍、氟化物的去除率为100%、57.6%、76.5%;(3)实际工程应用中,添加0.1%Na₂S₂O₃和1.5%Ca(OH)₂进行搅拌、养护7 d后,目标污染物浸出浓度均低于《地下水质量标准》(GB 14848—2017)Ⅳ类标准,达到修复目标。本项目成功实施为同类型重金属含氟复合污染土壤固化/稳定化技术实施提供理论和经验支持。