一株小反刍兽疫病毒的分离鉴定与生长曲线测定

将含高滴度小反刍兽疫病毒的新鲜病料研磨后接种VERO DS细胞系进行病毒分离,出现细胞病变后连续传代,取3代以上培养物,进行RT-PCR和间接免疫荧光试验及生长曲线测定。生长曲线测定分别以0.01和0.1 MOI接种VERO DS细胞,每隔12h测定病毒滴度,连续培养168h,绘制病毒生长曲线,分析生长特性。结果显示,病料接种细胞72h后,出现细胞病变,经RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为小反刍兽疫病毒?;生长特性研究显示,0.01和0.1 MOI两种病毒接种量,病毒滴度最高均为106 TCID50左右,但峰值出现时间和下降速度存在差异,0.01 MOI接种量出现峰值晚,但是维持高滴度时间较长。本文成功分离一株小反刍兽疫病毒,并对两种接毒量的生长特性差异进行了初步分析,为探索该病毒培养方法和收毒时间提供了借鉴。     

我国小反刍兽疫疫情现状与防控策略

小反刍兽疫作为重要的跨境动物疫病之一,已经传入我国并广泛流行。对我国养羊业、民生和经济发展造成沉重的打击。为有效防控该病,从小反刍兽疫的病原学、宿主范围,传播特点、传播因素和综合防控的策略等方面进行了概述,重点从制度保障和防控要素方面进行分析,旨在为我国小反刍兽疫的防控提供理论支持。     

小反刍兽疫病毒分子生物学与疫苗研究进展

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是小反刍动物一种重要的传染病,是世界动物卫生组织规定的A类传染病,在我国被列为一类动物疫病,具有很高的发病率和死亡率,该病的广泛流行,给世界养羊业造成了巨大的损失。特别是该病2007年第一次在我国报道后,更应加强对它的研究。文章主要叙述了小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)分子生物学的研究情况,特别是主要基因特征和结构蛋白的功能,并对小反刍兽疫疫苗的使用和最新研究进展进行了总结。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

心水病病原体高度保守基因合成与原核表达

通过软件DNAStar分析,设计合成心水病病原体抗原性、保守性比较高的一段基因,长度为564bp,将它插入pUC57载体,再转入pET-32a质粒中进行原核表达并纯化表达产物。结果表明,合成的基因在大肠杆菌中得到高效表达并能简易地提纯,纯化的表达产物有望用于心水病免疫学检测;此合成外来基因还可以作为心水病病原PCR检测的阳性对照。这些工作为我国建立心水病防控技术储备奠定了一些基础,也为防控高度危险性外来传染病提供一种安全和可行的研究新思路。     

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

壳寡糖抗氧化性及对鲫鱼保鲜性能的研究

[目的]研究壳寡糖的抗氧化性及壳寡糖对冷藏鲫鱼保鲜性能的影响.[方法]以壳寡糖为原料,采用邻二氮菲-Fe2氧化法、DP-PH法等对壳寡糖的抗氧化性进行了测定,以pH、TVB-N及TBA为指标研究了壳寡糖对鲫鱼保鲜性能的影响.[结果]研究表明,1.5mg/ml壳寡糖溶液的还原能力相当于50 μg/ml阳性对照VC的还原能力;1 mg/ml壳寡糖溶液对羟自由基的清除率为45％,相当于100μg/ml阳性对照VC对羟自由基的清除率;4 mg/ml的壳寡糖溶液对DPPH自由基的清除率达到97.8％.新鲜鲫鱼在4℃冰箱冷藏条件下,壳寡糖溶液涂膜处理组和对照组在第8天时的TVB-N值分别为252.0和196.0 mg/kg;pH分别为7.73和6.69;TBA值分别为1.552和0.670.综合各项指标的变化,壳寡糖涂膜保鲜的鲫鱼货架期明显比对照组长,表明壳寡糖具有较好的抗氧化能力和保鲜性能.[结论]研究可为壳寡糖在更多领域更广泛的开发应用奠定基础.     

新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

小反刍兽疫病毒分离株China/Tib/07辅助质粒及微型基因组的构建和鉴定

本研究旨在构建小反刍兽疫病毒(PPRV)的辅助质粒和微型基因组并验证其功能,为建立PPRV反向遗传操作平台奠定基础.首先构建表达PPRV分离株China/Tib/07的N、P和L蛋白的辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L.通过间接免疫荧光试验验证3个辅助质粒转染细胞后的蛋白表达情况,并从mRNA水平上验证蛋白表达的正确性;扩增PPRV基因组两末端序列和eGFP报告基因,三者通过overlap-PCR连接并克隆至转录载体pOL-TV5中构建微型基因组.将构建的微型基因组分别与辅助病毒和3个辅助质粒进行共转染.经鉴定各辅助质粒完全正确,构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与3个辅助质粒共转染,报告基因均表达.本试验成功构建了PPRV分离株的表达N、P和L蛋白的3个辅助质粒以及微型基因组,并用微型基因组验证了3个辅助质粒可以作为PPRV反向遗传操作的辅助质粒,为该病毒感染性克隆的构建奠定了基础.