鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白密码子偏爱性分析

为给鸭肠炎病毒（DEV）核衣壳蛋白（NP）基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EM-BOSS软件包CHIPS和CUSP程序对DEVNP基因进行了密码子偏爱性分析。结果显示,DEV NP基因的ENC值为51.180,编码NP蛋白的A、I等氨基酸不同密码子的使用频率存在一定的差异;从与DEV NP基因密码子使用频率比值上看,大肠杆菌22个、酵母18个、鸭12个和人20个密码子存在较大的偏爱性。由此可见,编码DEVNP蛋白密码子出现频率较均一,且酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。     

DEV核衣壳蛋白二级结构与B细胞表位预测

为预测和分析鸭肠炎病毒NP蛋白的二级结构和B细胞表位,以DEV-NP基因推导的氨基酸序列为基础。采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构;按Kyte—Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测其B细胞抗原表位。结果表明,DEV-NP蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角、无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋与β-折叠区段,且在蛋白肽链中有多个区段可形成B细胞抗原表位,其中第10—15和182—186区段及其附近可能是DEV-NP蛋白的B细胞表位优势区。