牛支原体与无乳支原体的相似性比对分析

运用生物信息学方法对牛支原体(Mycoplasma bovis)和无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)的相似性进行多重比对分析。使用Mega 7、Clustal a、Sibeilia等生物信息学软件对M.bovis与M.agalactiae的全基因组、16S rRNA、脂蛋白家族进行相似性比对分析。通过多重比对发现,M.bovis与M.agalactiae在全基因、16S rRNA、以及脂蛋白家族方面均表现出较高的相似性。     

猪肺脏气道上皮干细胞的特异抗体筛选与抗原表达研究

猪肺脏气道上皮主要由基底细胞,克拉拉细胞,纤毛细胞,杯状细胞等上皮细胞类型组成,筛选猪气道上皮干细胞的相关特异性抗体,观察其特异抗原的表达,将有助于对猪气道上皮干细胞的分离、鉴定和生物学特性的研究.试验中,制备远端气道上皮细胞的冰冻切片与细胞爬片,利用免疫荧光染色法,分析不同物种来源的抗体对猪气道上皮细胞的免疫染色反应;同时利用Oct3/4、Sox2、CD133和SSEA-1等10种上皮干细胞相关抗体分析猪气道上皮干细胞表面抗原表达情况.通过试验,筛选出在猪气道上皮干细胞相关抗体,并发现气道组织冰冻切片未检测到这10种抗体相关的阳性细胞,而在细胞爬片中观察到CD49f和CD117阳性细胞数量较多.免疫荧光共染发现这些CD49f和CD117阳性细胞同时也表达基底细胞表面标记Keratin 14.这可能是正常情况下猪气道上皮干细胞数量极为稀少,表面抗原表达量低而不易检测到,在肺脏气道上皮受到外环境刺激时(如消化),上皮干细胞开始增殖以完成损伤修复作用发生数量上的增殖.综上所述,利用Keratin 14和CD49f或CD117(c-kit)双标染色法可以鉴定猪肺脏气道上皮干细胞的候选亚群来用于其生物学特性与功能的研究.     

绵羊肺炎支原体hlyA基因的表达及活性初步鉴定

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)可引起绵羊(Ovis aries)及山羊(Capra hircus)的支原体性肺炎,分布广泛,危害严重.本实验在课题组前期完成MO Y98株基因组测序的基础上,通过基因注释、PCR等获得了该菌株可能的溶血素(hemolysin,hlyA)基因;依据大肠杆菌(Escherichia coli)优势密码子对hlyA基因进行优化,构建优化后hlyA原核表达质粒pET32a-hlyA;将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,获得了相应的重组菌株,并对重组菌株进行诱导表达;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定,并经Ni2+金属螯合柱纯化.克隆了MO hlyA基因序列(GenBank登录号:KT598390),片段大小为375 bp,编码125个氨基酸.优化后密码子适应指数为0.91,目的基因适于在大肠杆菌中表达.重组融合蛋白多以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为31.6 kD,与预期大小一致.Western blot结果显示,上清中纯化出的目的蛋白能与一抗发生反应,重组蛋白特异性较好.溶血实验表明,当纯化后蛋白浓度稀释到0.125 μg/mL时,溶解红细胞的能力已经下降.该研究结果为后续绵羊肺炎支原体致病性研究提供了基础资料.     

结核分枝杆菌输出重复蛋白(Erp)8基序突变体的构建及表达分析

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的古老疾病,与艾滋病、疟疾一并成为当今世界威胁人类健康的三大传染病。输出重复蛋白(Erp)是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子,在临床上具有一定的潜在应用价值。为了深入研究Erp的功能,本研究采用固相亚磷酰胺三酯化学方法合成包含8个PGLTS基序的基因Dom8,并利用重叠延伸PCR的方法将该片段与DomC(长度为520～855bp)连接,经基因组装得到Erp蛋白8基序突变片段。进一步对获得的8基序全长基因进行C端、N端及CN两端缺失突变体,将其构建至原核表达载体pET-28a(+)上,将经酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pLysS菌株中。利用Tricine/SDS-PAGE、Western blot检测结核分枝杆菌Erp重组蛋白的表达情况。结果显示,通过重叠延伸PCR法成功扩增了erp基因PGLTS8基序全长及8基序C-端、N-端和CN-端缺失突变体并构建至原核表达载体,经IPTG诱导后,用Tricine/SDS-PAGE得到大小分别约为13.0、17.1和6.7kD的目的蛋白。制备弗氏佐剂疫苗免疫试验兔,ELISA测定抗体效价,血清效价达到1:512倍时,即可心脏采血分离,制备抗血清,并对提取的蛋白进行Western　blot检测,结果表明,一抗为l:200倍稀释的兔阳性血清,二抗为1:800倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG-HRP;Western blot检测ErpMutC8、MutN8和MutCN8,结果显示,仅目的蛋白ErpMutC8和MutN8能被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,表明,BL21(DE3)pLysS(pET28a-C8)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-N8)所表达目的蛋白表达特异,可以被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,具有良好的抗原性。研究结果为深入研究Erp的功能,制备结核病的诊断抗原和基因工程重组疫苗提供基础资料。     

猪肺炎支原体的免疫原蛋白及疫苗的研究进展

猪肺炎支原体是引起猪支原体肺炎的主要病原,严重危害着养猪业的发展。本文综合国内外猪肺炎支原体主要免疫原及疫苗的研究进展,从而为猪肺炎支原体致病机理的进一步研究及该病的防治提供新思路。     

奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌耐药性及生物被膜形成相关基因的研究

目的 在分离奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌的基础上,分析表皮葡萄球菌的耐药性、生物被膜形成能力及生物被膜形成相关基因的特点,为研究表皮葡萄球菌生物被膜的形成及其毒力因子引起奶牛乳腺炎的发病情况及机制奠定基础。方法 通过K-B药敏纸片法对分离的表皮葡萄球菌进行敏感性检测,用刚果红平板法筛选被膜阳性菌,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力,利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察和分析生物被膜的形成形态,应运PCR法对ica AB、ica A、ica B、ica C、icaR、aap、bap、fbe、atl E、sig B、sar A和agr基因进行扩增。结果 本实验采集了368份患奶牛乳腺炎的乳样,分离得到15株表皮葡萄球菌,产生物被膜阳性菌7株,检出率46.7%。分离株对青霉素的耐药性最高,对阿米卡星、头孢噻肟、林克霉素等的耐药性较强,但对环丙沙星和万古霉素的敏感性较高。形态学观察发现48 h时生物被膜厚度和结构更为复杂。bap、ica AB、aap、sar A、fbe、atl E、sig B和agr 8种基因在分离株中扩增出与预期大小一致的片段。结论 本实验结果表明表皮葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的一种主要致病菌,其生物被膜阳性菌株比例较高,阳性菌株的耐药性明显高于被膜阴性菌,同时atl E、sig B、agr和fbe 4种毒力因子均存在于生物被膜阳性菌中。     

结核分枝杆菌BCG和H37Ra对巨噬细胞凋亡的影响及其机制研究

在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)与宿主巨噬细胞的相互作用中,巨噬细胞的凋亡对抵御及杀灭MTB起着重要的作用。为了探讨MTB的BCG和H37Ra两个弱毒株对巨噬细胞凋亡的影响及其相关机制,本研究比较了体外培养的BCG和H37Ra两种菌株感染小鼠(Mus musculus)巨噬细胞后对细胞凋亡的影响,并检测了肿瘤坏死因子-alpha(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达情况。结果发现,与对照组相比,BCG和H37Ra感染后显著提高了巨噬细胞的凋亡率(P<0.05),TNF-α和Caspase-3的表达及活性也显著增加(P<0.01或P<0.05),同时极显著抑制了Bcl-2的表达(P<0.01)。但BCG感染组细胞凋亡率极显著高于H37Ra组(P<0.01),BCG感染组Caspase-3的表达和活性极显著高于H37Ra组(P<0.01),而Bcl-2和TNF-α的表达在BCG和H37Ra感染组间差异不显著(P>0.05)。结果提示,BCG和H37Ra两个弱毒株感染后对巨噬细胞凋亡的影响不同,可能与Caspase-3的表达相关,而与Bcl-2和TNF-α的表达无关。本研究为深入研究MTB毒力与巨噬细胞凋亡的相互作用机制提供了基础资料。     

利用基因工程技术提高玉米赖氨酸含量的研究进展

玉米是重要的粮食和饲料作物,但玉米中赖氨酸含量较低,降低了其营养品质及蛋白利用率。常规育种的方法提高玉米赖氨酸含量收效甚微,随着生物技术的不断发展,基因工程技术的不断进步,为提高玉米赖氨酸含量,改良玉米品质提供了一条新的技术路线。综述了近年来利用基因工程技术提高玉米赖氨酸含量的研究进展以及对未来的展望。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。