河南良杂猪白细胞介素-18成熟蛋白基因的克隆及表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18基因成熟蛋白序列.序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-IL18,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确.     

河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)又称为干扰素γ诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF).Okamura and Tsutsui(1995)首次从中毒性休克的鼠肝脏中克隆出了该因子.Muneta et al.(1999,2000)从猪肺泡巨嗜细胞中克隆到pIL-18,并证明表达pIL-18的成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性.本研究选择河南省普遍喂养的良杂猪,对其IL-18基因进行扩增及序列测定,并实现了成熟蛋白在大肠杆菌中的初步表达.     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达

RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T pIL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在.     

中国茶叶包装的装饰纹样设计

本文以茶叶包装文化概述作为出发点,从创新元素的运用和中国画纹样的创作方法等方面探讨了中国茶叶包装的装饰纹样设计相关知识,以期为提高茶叶包装审美化提供一些参考和意见。     

猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立与检测

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白.     

猪流行性腹泻病毒疫苗研究进展

猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,目前尚无有效的治疗药物,接种疫苗仍是主要预防措施。自1971年首次发现PEDV以来,该病毒便不断发生变异并出现了大范围传播,有关PEDV疫苗的研究工作也在不断完善,但免疫效果并不理想。疫苗的安全性和有效性是疫苗研发的首要因素。传统灭活疫苗安全性好,但需多次大量接种;弱毒疫苗免疫原性强,但易毒力返祖;新型亚单位疫苗与灭活疫苗类似,保证抗原蛋白的天然构象、提高免疫原性是今后研发的重点;重组活载体疫苗中的载体本身就充当了“免疫增强剂”的角色,而另一方面,致弱后的载体能否稳定遗传及其安全性还需更深入的研究;面对变异速度极快的冠状病毒,第三代核酸疫苗只需简单修改相应基因即可迅速投入使用,而这类疫苗存在很大的缺口,未来需要侧重于核酸疫苗的研发;利用转基因植物生产疫苗可避免其他动物病原的污染,无需低温储存,植物细胞壁可对抗原蛋白进行保护,避免被酶消化,稳定性好,但这类疫苗在进...     

猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。