牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

猫贫血的病因及诊断

贫血是猫常见的临床症状之一,笔者就猫贫血最常见的病因作一归纳,以期为临床兽医工作者提供一些参考。1贫血的病因造成贫血的原因大致可分为红细胞生成减少,红细胞丢失和红细胞破坏增多等三大类。红细胞生     

猫贫血的传染性病因及诊治

贫血是猫常见的临床症状之一,但许许多多的其他因素往往掩饰了潜在的传染性疾病.本文就猫贫血最常见的传染性病因作一归纳,以期为临床兽医工作者提供一些参考.理论上,所有致病因子均可通过炎性反应引起贫血,也可经炎性疾病使贫血加重,但这些临床表现均较轻微,往往不是临床就诊的主要原因.     

小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

本实验以中药提取物小檗碱为研究对象,探究其对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用。实验采用常量肉汤稀释法测定小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC);随后分别选取2 MIC、1 MIC、0.5 MIC浓度小檗碱,采用结晶紫染色法测定其对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的抑制率,同时采用实时荧光定量PCR测定2 MIC、1 MIC、0.5 MIC小檗碱对金黄色葡萄球菌Nuc基因的表达情况。结果显示,小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为62.5 μg/mL,2 MIC、1 MIC、0.5 MIC浓度小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率分别为77.14%、66.91%和55.55%,荧光定量PCR测得各组金葡菌Nuc基因的Ct值大小为Ct值(0.5 MIC)> Ct值(1.0 MIC)>Ct值(2 MIC),说明随着小檗碱浓度的增大,对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增强,呈现明显的浓度依赖性。本研究为小檗碱对金黄色葡萄球菌感染的防治提供数据支持。     

牛诺如病毒及牛嵴病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据BNoV和BKoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,建立了能同时检测牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNo V)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKo V)的双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增BNo V和BKo V的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105 copies/μL和2.23×106 copies/μL;对临床采集的127份犊牛腹泻样品检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKoV的阳性率为4.72%(6/127),两者与单一PCR检测结果相一致,符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,可用于BNoV和BKoV的快速检测和流行病学调查。     

葛根芩连汤对抗生素相关腹泻肠道乳酸杆菌属的影响研究

为了探讨葛根芩连汤对抗生素相关腹泻模型肠道中乳酸杆菌属的调理作用,运用氨苄青霉素灌胃建立巴马猪抗生素性腹泻动物模型,用葛根芩连汤进行治疗,处死巴马猪并收集不同位置的肠道内容物(包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)作为检测样品;通过建立定量检测乳酸杆菌属的荧光定量PCR方法,对葛根芩连汤治疗前后肠道内乳酸杆菌的动态变化进行检测。结果显示,与正常对照组相比,模型组肠道内乳酸杆菌属含量显著降低(P0.01);与模型组相比,葛根芩连汤治疗组乳酸杆菌在各个肠段中数量明显上升(P0.05)。长期使用抗生素会引起肠道内优势杆菌乳酸杆菌属数量明显减少;葛根芩连汤对抗生素相关腹泻模型肠道乳酸杆菌属具有调理作用。     

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSVNsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×10⁴~1×10⁸拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36 h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。     

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组（P<0.05）,是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。