鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备方法的比较

提取鸡X期胚盘细胞,体外培养传至第3代,采用口吸管法、细胞稀释法及克隆环法将细胞集落分离成单个细胞,并将其接种至96孔板上,每孔1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物,探讨鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备的实际操作的可行性,并对其生物学特性进行鉴定.结果表明:口吸管法、克隆环法、细胞稀释法克隆率分别为0、1.0%、4.2%.3种方法相比较,细胞稀释法具有操作简单易行、实验时间短、对细胞伤害小等优点,经碱性磷酸酶活性和阶段特异性表面抗原1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖且不分化.     

鸡胚精原干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

研究体外定向诱导鸡胚精原干细胞(spetmatogonial stem cells,SSCs)向脂肪细胞分化的能力.取孵化16 d的鸡(Gallus gallus)胚睾丸,提取SSCs,体外培养和传代.采用不同的诱导程序和不同组合的诱导剂(地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX))诱导SSCs向脂肪细胞分化.结果显示,诱导SSCs7～2l d后,分化成脂肪细胞,其中地塞米松、胰岛素和IBMX联合使用3 d后更换为胰岛素作用l d,经过3次循环后,用胰岛素继续处理至21 d,这一方法的诱导分化效果较好,分化率为85%.高于诱导剂联合协同作用的诱导效果(P<0.01).同时诱导剂联合作用协同作用的诱导效果高于单独作用的诱导效果(P<0.01).诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性,并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ.表明SSCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异性化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞.     

鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备

从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、5．5&#215;10^-5mmol／L β-巯基乙醇、10μL／mL非必需氨基酸、以及含1000U／mL LIF、10ng／mL bFGF和5ng／mL SCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第X期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2％和1．0％。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。     

鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建

利用高保真RT-PCR的方法从Poly（I）&#183;Poly（C）诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长Mx cDNA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明：正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。     

“睡美人”转座子系统介导EGFP转染鸡SSCs条件优化的研究

利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力.结果表明,在SB与PT-EGFP的比为1:10,质粒浓度为15μg/mL,细胞处于对数生长期,且细胞密度为106~107/mL时,精原干细胞在电场强度为270V,脉冲时程为80μs,转染后在4℃静置10 min的条件下转染效率最高.浓度为400 μg/mL的G418对转染后的SSCs进行快速筛选6d时,出现了EGFP阳性克隆.     

鸡精原干细胞定向诱导分化特性的研究

取孵化18～20d的鸡胚睾丸，分离精原干细胞（SSCs），培养传代3次后，用特异性化学物质定向诱导分化，以研究鸡培养传代后SSCs保持多向分化的潜能。①用特异的化学物质地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C诱导鸡SSCs向成骨细胞分化，用Von Kossa＇s法、改良的钙钴法及免疫组化法进行成骨细胞鉴定；②用维甲酸（RA）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向神经元样细胞分化，甲苯胺蓝特异染色和组织化学鉴定。③用地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向脂肪细胞分化，特异性的油红O染色和脂肪细胞标志基因PPAR7检测。结果显示，SSCs被诱导15～21d后分化为成骨细胞，诱导形成率为80％；Von Kossa＇s染色细胞间布满黑色颗粒，具有矿化基质沉积；改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色，免疫组化染色细胞呈阳性。SSCs被诱导3～7d后分化为神经元样细胞，甲苯胺蓝染色阳性率为85％。SSCs被诱导7～21d后，分化成脂肪细胞，分化率为85％。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性，并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ。结论：在不同的诱导条件下，SSCs可被定向诱导分化为3种成体细胞，证明其培养传代后仍具有多向分化能力。     

鸡胚胎干细胞的分离和培养

实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。