pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体,制备转双基因(pGH+IGF-Ⅰ)猪,以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响,为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA,经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列,经酶切连接克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体上,构建pc DNA3.1(+)-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞,Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子,采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体,Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明,成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体,转染PK15细胞后,Q-PCR检测表明,pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪,经PCR及测序检测,其中4头仔猪为转双基因阳性,转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因,证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在,并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因,证明外源基因存在稳定传代的可能。     

犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为170 bp (CBoV)和239 bp (CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板,进行二联PCR扩增试验。结果表明,本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证,二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA,而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测,其中,4份为CBoV阳性,3份为CCV阳性,未检测到混合感染。综上所述,本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高,敏感性好,可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。     

猪细小病毒1型突变株分离鉴定及全基因组进化分析

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养，经电镜观察和IFA试验进行鉴定，通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增，SnapGene V4进行序列拼接和比对，利用DNAMAN V6对基因组末端5′UTR和3′UTR二级结构进行展示和比较，应用MEGA V7进行遗传进化分析，最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒，均鉴定为PPV1型毒株，分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致，其中5′-UTR序列高度保守，呈Y型结构；而3′-UTR呈U型结构，个别碱基有所差异；VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点，分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示，突变株生长趋势相对较快，与PPV-QN株相比，最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。