家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析

家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。     

金银花糖基转移酶基因LjUGT71E1的克隆及原核表达

糖基化广泛存在于生物体中,具有非常重要的作用,而糖基转移酶则是催化糖基化反应的关键酶。本研究根据转录组数据库,设计引物从金银花(Lonicera japonica Thunb.)中克隆得到一个糖基转移酶编码基因LjUGT71E1,序列分析表明该基因的CDS为1 503 bp,理论可编码氨基酸数目为501,等电点(p I)预测为5.09,理论分子量为55 579.71 Da。多重序列比对表明LjUGT71E1与其它植物UGT71家族成员在序列上保守性很高,并且其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的糖基转移酶所具有的保守的PSPG-box基序。系统发生分析表明LjUGT71E1与人参(Panax ginseng)和甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UGT71E亚家族成员聚为一支。荧光定量PCR分析表明,该基因在金银花的五个花期均有表达,在幼蕾时期相对表达量达到峰值。进一步构建了LjUGT71E1基因的原核表达载体并且在大肠杆菌中诱导表达得到重组蛋白,为后续的功能研究提供了基础。     

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmHP21的克隆及表达分析

丝氨酸蛋白酶参与昆虫对抗入侵病原体及保护受伤组织的黑化反应。为了探讨家蚕黑化反应过程中丝氨酸蛋白酶在酚氧化酶原前体级联体系的作用,克隆了家蚕的一个新的丝氨酸蛋白酶基因,命名为BmHP21(GenBank登录号:JF431073)。该基因由1 233个核苷酸组成,编码410个氨基酸。通过SMART网站预测蛋白结构显示BmHP21包括一个clip结构域和一个胰蛋白酶结构域。BmHP21蛋白和烟草天蛾Ms-HP21的氨基酸序列有55%的相似性,推测BmHP21在家蚕黑化反应中起着激活酚氧化酶原前体激酶(PPAE)的作用。RT-PCR检测结果表明,BmHP21在家蚕大部分组织包括脂肪体中都有表达,其mRNA转录几乎贯穿于整个家蚕的幼虫、蛹和成虫发育阶段,推测BmHP21除了参与黑化反应外,还有其它的生理功能。     

金银花香豆酸-3-羟化酶基因LjC3H2的克隆及表达分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是催化绿原酸生物合成的关键酶之一。本研究在金银花中克隆得到一个与前人报道的LjC3H同源的基因,命名为LjC3H2(Gen Bank登录号:KX845342),利用生物信息学方法对该基因的序列特征、家族分类、保守结构域、系统发生等进行了分析,并利用荧光定量PCR研究了该基因在金银花花发育过程中的表达模式。研究结果表明该基因编码框全长1 521 bp,编码506个氨基酸残基,理论等电点为8.92,理论分子量为57.4 k D。LjC3H2与其它植物C3H同属于细胞色素P450家族CYP98A亚家族,亚家族成员之间序列上高度保守,都含有保守的细胞色素P450结构域及保守基序,包括Heme-binding region、PERF motif、K-helix region和I-helix region。系统发生分析表明金银花两个C3H聚为不同的分支,LjC3H2与刺苞菜蓟C3H和桔梗的C3H聚为一支。荧光定量PCR结果表明LjC3H2在幼蕾期的表达水平最高,在金花期最低,整体表达水平随着花的发育呈整体下降趋势;而LjC3H除绿蕾期外整体上呈表达上升的趋势,两个C3H在花的发育过程中呈现出相反的表达模式,这可能是由于在植物进化过程中底物特异性和催化特异性的进化而导致的功能分化。该研究为金银花绿原酸生物合成机制的研究提供了重要的信息。     

不同品种忍冬在江苏地区引种栽培的生物学特性研究

以忍冬不同品种为试材,研究其在江苏地区生长后植物形态和开花特性,以期为江苏地区忍冬优良品种的筛选提供科学依据。结果表明:忍冬各品种间枝条、叶、花、苞片等主要形态特征存在显著差异。其中"金丰1号"、"四季树形"及"山东红银花"在江苏地区栽培后各生物学性状表现良好,生态适应性强,筛选出的优良种质可在江苏地区推广种植。     

光强对金银花药材性状、光合特性及抗氧化酶活性的影响

采用人工遮阴方式研究了不同光照强度对金银花药材性状、光合特性及抗氧化酶活性的影响。结果表明:随着光强减弱,金银花的花蕾长和单花鲜重呈先升高后降低的趋势,单花干重降低,光合色素含量逐渐增加,叶绿素a/b值减小,净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均呈下降趋势,气孔限制值(Ls)增大,丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性先降后升;随着处理时间延长,MDA含量增加,SOD、CAT和POD活性则先升后降。因此,50%透光率有利于金银花的生长,而强光和弱光可对植株形成光抑制或弱光胁迫。     

金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析

在药用植物金银花中克隆了开花整合基因LjFT(Genbank登录号：OP700454)，并对其开展了生物信息学分析和不同花器官中的表达分析。结果表明：金银花LjFT基因包含4个外显子和3个内含子，编码框长度为525 bp，编码174个氨基酸残基，其所编码的蛋白质与其他植物FT序列高度保守；基于SWISS-MODEL和Alphafold 2这2种方法进行的蛋白结构预测表明金银花LjFT与拟南芥FT在蛋白质三级结构上高度保守；启动子分析表明LjFT启动子序列中含有大量激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件；系统进化分析表明LjFT与绣球HmFT亲缘关系最近；表达分析表明LjFT主要在花蕾期高量表达，尤其是花萼和花瓣中，开花后表达水平迅速降低。