亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

一个潜在催化莱鲍迪D苷合成的新型糖基转移酶

尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)催化糖基转移反应,与植物次生代谢密切相关。本研究根据甜叶菊(Stevia rebaudiana)转录组数据库,克隆到一个催化莱鲍迪D苷(rebaudioside D,RD)合成的新型糖基转移酶候选基因,对其开展生物信息学分析。结果表明,该基因开放阅读框长1380 bp,编码459个氨基酸,等电点(pI)预测为5.54,理论分子量约49.66 kD,系统发育分析表明该基因与向日葵中的UGT89A2同源,故将其命名为SrUGT89A2。构建pET28a-SrUGT89A2原核表达载体,并在大肠杆菌(BL21(DE3))中诱导表达得到重组蛋白,HPLC检测表明粗酶液能催化甜叶菊提取液形成一个新的色谱峰,该峰保留时间与莱鲍迪D苷一致。经进一步纯化UGT89A2蛋白,添加不同甜菊糖苷标准品为催化底物,但未鉴定出该蛋白催化的具体糖苷。该潜在催化甜菊糖RD苷合成的新型糖基转移酶基因SrUGT89A2的发现,为RD苷的生物合成和甜菊糖苷的生物途径研究提供新的理论依据。     

杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶,可参与催化受体分子进行糖基化修饰。本研究以杜仲为材料,基于前期构建的杜仲转录组数据设计杜仲糖基转移酶编码基因EuGT2克隆引物,克隆得到全长为285 bp的EuGT2片段,序列分析表明,该基因可编码94个氨基酸,且EuGT 2蛋白结构预测表明,该蛋白分子量为11.2 kDa,理论等电点(pI)为7.88,无信号肽、无跨膜结构域,属疏水性蛋白。蛋白同源序列比对以及系统进化树分析结果表明,与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)的糖基转移酶CcGT 6的亲缘关系较近,序列同源一致度为69.14%。Real-time PCR分析表明,EuGT2基因在杜仲初生幼苗期(2片真叶)的根、茎和叶中表达量没有显著差异性,而在杜仲小苗期(初生)的各器官中出现显著差异,其中EuGT2在茎中的表达量最高,分别为幼苗生长30 d左右根和叶片中表达量的2.5倍和5.5倍。     

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT的克隆与表达分析

本研究以发育18d的天然棕色棉及相同发育时期的白色棉近等基因系纤维细胞为材料,采用抑制性差减杂交结合RACE技术分离得到了一个葡萄糖苷转移酶基因的全长cDNA,命名为Gh3GT(GenBank登录号eu921265)。序列分析发现:该基因编码一条有450个氨基酸残基组成的多肽,含有葡萄糖苷转移酶C-端所特有的保守的信号序列PSPG基序,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。推断的Gh3GT编码产物与其它糖苷转移酶同源性比对和系统发生分析表明:该糖苷转移酶与玫瑰Rh3GT(Rosa hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)PhF3GT以及葡萄VvUFGT(Vitis vinifera)的相似性分别为51.30%、46.94%和45.85%,而与已知的陆地棉糖苷转移酶基因GhUGT1和GhUGT2一致性较低,仅为25.37%和12.14%。半定量RT-PCR分析表明:该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其它组织及其近等基因系白色棉品种,且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

绞股蓝皂苷生物合成后修饰酶基因的cDNA克隆和组织表达特征

从绞股蓝转录组挖掘可能与绞股蓝皂苷生物合成相关修饰酶基因细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)及UDP-糖基转移酶(UDP-dependent glycosyltransferase,UGT)基因的cDNA进行克隆并开展了以下研究。根据课题组前期绞股蓝转录组数据,筛选CYP及UGT Unigenes,利用RT-PCR克隆ORF全长,并结合生物信息学对其编码蛋白进行功能分析,最后通过荧光定量PCR验证其在根、茎、叶的差异性表达。结果克隆得到两个ORF序列,分别命名为CYP94A1和UGT91A1;CYP94A1序列包含1509 bp的开放阅读框架,编码一条含503个氨基酸残基的肽链,具有CYP保守结构域;UGT91A1序列包含1383 bp的开放阅读框架,编码一条含461个氨基酸残基的肽链,具有UGT保守结构域。这两个基因的转录表达均具有组织特异性,在叶或茎中的表达均高于根。CYP94A1和UGT91A1的克隆、转录表达及生物信息学分析为进一步挖掘绞股蓝中CYPs、UGTs及功能验证提供了帮助,增加对CYP和UGT两个超基因家族的认识。     

金银花香豆酸-3-羟化酶基因LjC3H2的克隆及表达分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是催化绿原酸生物合成的关键酶之一。本研究在金银花中克隆得到一个与前人报道的LjC3H同源的基因,命名为LjC3H2(Gen Bank登录号:KX845342),利用生物信息学方法对该基因的序列特征、家族分类、保守结构域、系统发生等进行了分析,并利用荧光定量PCR研究了该基因在金银花花发育过程中的表达模式。研究结果表明该基因编码框全长1 521 bp,编码506个氨基酸残基,理论等电点为8.92,理论分子量为57.4 k D。LjC3H2与其它植物C3H同属于细胞色素P450家族CYP98A亚家族,亚家族成员之间序列上高度保守,都含有保守的细胞色素P450结构域及保守基序,包括Heme-binding region、PERF motif、K-helix region和I-helix region。系统发生分析表明金银花两个C3H聚为不同的分支,LjC3H2与刺苞菜蓟C3H和桔梗的C3H聚为一支。荧光定量PCR结果表明LjC3H2在幼蕾期的表达水平最高,在金花期最低,整体表达水平随着花的发育呈整体下降趋势;而LjC3H除绿蕾期外整体上呈表达上升的趋势,两个C3H在花的发育过程中呈现出相反的表达模式,这可能是由于在植物进化过程中底物特异性和催化特异性的进化而导致的功能分化。该研究为金银花绿原酸生物合成机制的研究提供了重要的信息。     

棉花GhUGT75L6的生物信息学分析及功能验证

糖基转移酶(glycosyltransferases, GT; EC 2.4.x.y)是植物体内催化糖基化的主要酶,在催化次生代谢物合成、调节激素平衡以及参与植物非生物胁迫等方面发挥着重要的作用。为了更好地探究棉花中糖基转移酶的结构与功能,本研究通过生物信息学分析初步探究了GhUGT75L6基因编码蛋白的理化性质、二级结构、三级结构。采用实时荧光定量技术检测了GhUGT75L6基因在棉花中的表达情况。从棉花中克隆糖基转移酶基因GhUGT75L6,并将构建的过表达载体pBI121-GhUGT75L6转入拟南芥,对转基因拟南芥T3代种子进行功能验证。结果表明GhUGT75L6编码的蛋白分子量为52.624 kD,不含跨膜结构域,具备糖基转移酶所特有的UDP-glycosyltransferases标签,是一种非分泌型亲水蛋白。qRT-PCR分析结果表明,棉花中GhUGT75L6的相对表达量在根中最高,茎部其次,叶中最低。使用25 mmol/L Na_2CO_3对转基因植株进行胁迫处理,发现野生型植株萎蔫程度更高,表明转基因植株的耐碱性得到了提高,GhUGT75L6参与了棉花抗逆的过程。     

大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定

UGT是一类糖基转移酶,它对黄酮类化合物进行糖基化修饰,合成异黄酮糖苷,在异黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。为了探索UGT功能,通过RT-PCR方法从中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列。利用ProtParam tool等在线软件对GmUGT73蛋白序列及理化性质进行分析,预测结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.186 5 ku,理论等电点(pI)为6.27,总原子数为7 176,分子式为C_(2281)H_(3580)N_(608)O_(685)S_(22)。GmUGT73蛋白总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白的不稳定系数为36.93,表明该蛋白较稳定,蛋白的脂溶指数为86.19,GRAVY值为-0.111,说明该蛋白为亲水性蛋白。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,通过发根农杆菌介导法转化大豆毛状根并获得转基因阳性根系,利用高效液相色谱(HPLC)对根系进行异黄酮含量测定,结果表明,转基因阳性根中异黄酮含量与对照相比极显著提高(P0.01),说明该基因可能具有促进合成大豆异黄酮的功能。     

七叶一枝花糖基转移酶基因的克隆及表达分析

糖基转移酶处于重楼皂苷生物合成途径的最后一步,催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化形成各种重楼皂苷,具有重要的研究价值。本研究通过对七叶一枝花进行转录组高通量测序、表达谱结合含量关联分析,筛选得到1条可能参与重楼皂苷生物合成的糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)候选基因。通过克隆,获得Pp-GT全长基因(GenBank登录号:MW208819),长度为1 443 bp,就Pp-GT的蛋白质序列及进化等进行了生物信息学分析,并对其基因表达模式进行了研究。该研究为下一步重楼皂苷合成途径的阐明和Pp-GT基因的功能验证提供了科学依据。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。     

独行菜UGT74B1基因的序列结构分析及时空表达特性

芥子油苷是独行菜种子的重要药用活性物质,也是重要的植物代谢调节物。但独行菜芥子油苷的合成途径及其调节还不清楚。为了探讨独行菜芥子油苷合成与生长阶段、组织器官的关系,本研究基于独行菜种子转录组数据库,以UGT (尿苷二磷酸-糖基转移酶)为关键词筛选在芥子油苷核心结构起修饰作用的关键酶基因序列,并对其结构及表达特性进行分析。结果表明,独行菜种子萌发中有98条Unigenes,其中一条c19350_g1与拟南芥UGT74B1相似性最高。进一步采用RT-PCR技术克隆到独行菜UGT74B1基因,命名为LaUGT74B1,结构分析显示,该基因的c DNA序列编码区为1 386 bp,编码产物为461个氨基酸的蛋白,蛋白的理论等电点为5.38,其不稳定系数为34.70,为稳定蛋白质,不具有跨膜结构。其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成,与独行菜与琴叶拟南芥、亚麻荠、荠菜的UGT74B1的序列相似性较高。另外,LaUGT74B1表达具有时空特异性,萌发阶段表达量呈现先下降后上升的变化趋势,苗期主要在叶中表达,花期主要在根中,结实期主要在老茎中。本研究结果可为独行菜芥子油苷生物合成途径阐明提供初步的试验基础。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

扁蓿豆DNA甲基转移酶基因MrDRM2的克隆和生物信息学分析

由DNA甲基转移酶催化的DNA甲基化在调控基因表达及植物生长发育中发挥重要作用。本研究根据扁蓿豆(Medicago ruthenica L.)的转录组测序信息设计特异性引物,利用RT-PCR技术从中克隆到1个DNA甲基转移酶基因的c DNA片段,长1 767 bp,编码588个氨基酸残基。利用生物信息学分析推测这个基因属于DNA甲基转移酶中的结构域重排甲基转移酶(domains-rearranged methyltransferases, DRMs)亚家族。系统发育分析表明该基因与豆科其他植物的DRM2基因具有较高的同源性。利用实时荧光定量PCR分析其在扁蓿豆受到低温(4℃)、Na Cl、干旱胁迫及ABA处理下不同时间的表达量,发现其表达受非生物胁迫诱导。推测MrDRM2基因参与了扁蓿豆对非生物胁迫响应的调控。本研究结果可进一步丰富扁蓿豆DNA甲基转移酶基因信息,为深入理解扁蓿豆DNA甲基转移酶基因的功能及其在非生物胁迫应答中的表观遗传调控提供一定的基础。     

毛果杨PtATAF1-1转录因子基因的克隆及功能分析

ATAF1蛋白是NAC转录因子家族的成员,在植物发育过程以及胁迫应答中有着重要的调控作用。在本研究中,利用cDNA末端的快速扩增技术,从毛果杨中克隆了一个ATAF1同源基因的全长cDNA,并将相应的基因命名为PtATAF1-1。生物信息学分析表明,Pt ATAF1-1全长cDNA序列为1 242 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码区长873 bp。氨基酸序列多重比对分析表明,PtATAF1-1蛋白质中具有NAC家族保守的NAM结构域;杨树原生质体瞬时表达Pt ATAF1-1显示其定位在细胞核中。此外,在细菌鞭毛蛋白N端保守区域(Flg22)和脱落酸(ABA)处理下,PtATAF1-1基因的表达水平诱导发生变化。本研究对PtATAF1-1基因的同源克隆与功能分析,为深入开展ATAF1基因在杨树中的功能提供了参考依据。     

滇牡丹类黄酮2'-O-萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

在被子植物中,2'-O-葡萄糖基转移酶能够影响花色色素分子的生物合成,在类黄酮上添加葡萄糖基配体,是形成黄色色素的关键酶。本研究采用RT-PCR技术首次从滇牡丹中克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮-2'-O-葡萄糖基转移酶(Pd2'GT)基因,对其进行生物信息学分析和转录模式分析。研究发现该基因全长1 428 bp,可编码的蛋白氨基酸475个,该蛋白无信号肽和跨膜结构,是一种在细胞质基质中发挥功能的不稳定蛋白;核酸序列与葡萄(Vitis vinifera)糖基转移酶的核酸序列具78%的一致性,说明该基因可能编码一个新蛋白,其蛋白序列含糖基转移酶超家族结构域PSPG,其氨基酸残基序列为WAPQVAILSHRATGG FVSHCGWNSILESLWFGVPIAALPMYAEQQ,含典型的糖基转移酶识别区和UDP糖基配体绑定位点;该蛋白与苹果(Malus domestica,NP_001315903)、西洋梨(Pyrus communis,D3UAG1)、仙客来(Cyclamen persicum,BAF75895)和长春花(Catharanthus roseus,BAF75901)的2'GT聚为一类,该组的糖基受体均为查尔酮;转录模式分析表明:Pd2'GT基因在黄色花瓣中表达量最高,在花蕾期该基因的积累水平最高。本研究通过对滇牡丹转录组数据的分析,分离并克隆得到Pd2'GT基因,为通过基因工程手段培育具新性状的观赏牡丹提供研究依据。