水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P2)过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P2在真核细胞发育中发挥重要功能.为探寻PtdIns(3,5)P2在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体.生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8～12个;保守结构域分析表明仅OsFAB1A和OsFAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_TCP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育.最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余.本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考.     

金银花花器发育时期与有效成分含量的关系

为研究金银花花器发育时期与有效成分含量的关系,以幼蕾期、青蕾期、白蕾期、银花期、金花期5 个不同发育时期的金银花样品为试验材料,采用高效液相色谱法(HPLC)法对绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的含量、累积量及比例进行研究。结果表明：（1）绿原酸、咖啡酸、木犀草苷以及异绿原酸A含量在青蕾期最高,分别高达27.29、0.22、0.84、0.36 mg/g,而异绿原酸B、异绿原酸C和总异绿原酸含量峰值出现在幼蕾期,分别为7.22、1.77、9.30 mg/g。（2）绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 和总异绿原酸累积量均在白蕾期最高,分别为82.19、4.12、5.56、101.67、23.05、130.07 μg/朵,仅有木犀草苷累积量最大值出现在青蕾期（10.39 μg/朵）。（3）随着金银花花器发育,绿原酸与木犀草苷比例先降低后增高,而异绿原酸A所占比例逐渐上升,异绿原酸B、C所占比例逐渐降低。金银花有效成分含量、累积量以及比例与发育时期密切相关,最适采收期为白蕾期。     

甘薯香豆酸3'-羟化酶基因的克隆和表达分析

香豆酸3'-羟化酶(coumarate-3-hydroxylase,C3H)是绿原酸代谢途径中的关键酶之一。为了揭示甘薯绿原酸生物合成途径和挖掘绿原酸合成相关基因,本研究从甘薯中克隆一个C3H的同源基因IbC3H。该基因全长1656 bp,包含一个1530 bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸。IbC3H蛋白具有典型P450家族蛋白结构特征,与牵牛花(Ipomoea nil)、马铃薯(Solanum tuberosum)、浆果状椒(Capsicum baccatum)和烟草(Nicotiana attenuate)中相应蛋白的同源性分别达到97.2%、85.4%、84.8%和84.8%。IbC3H启动子序列中含有脱落酸、赤霉素、乙烯和干旱等多个激素和胁迫响应元件,以及髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(MYB)、碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)、和WRKY蛋白等转录因子结合元件。荧光定量PCR结果显示,IbC3H在甘薯叶片中表达量最高,在茎中次之,而在块根中的表达量最低,与甘薯不同组织绿原酸含量正相关。本研究结果为进一步揭示IbC3H在绿原酸生物合成中的功能提供了依据。     

苎麻C3H基因的克隆、生物信息学分析及表达分析

旨在为后期验证C3H基因编码蛋白功能并最终实现低木质素优良苎麻品种的基因工程育种奠定基础。基于苎麻高通量测序信息,利用RACE技术克隆C3H基因全长序列,对其进行生物信息学分析;并利用荧光定量技术对苎麻C3H的表达模式进行研究。获得了全长为1940 bp的苎麻C3H基因c DNA序列Bn C3H-1(Gen Bank登录号为KY078743)。Bn C3H-1基因编码蛋白理化性质和结构的分析表明,该基因编码一个含511个氨基酸,分子量为57.80 k D的亲水性蛋白,它可能定位在内质网上。氨基酸序列和结构分析显示Bn C3H-1有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与巨桉和苦荞C3H基因具有很高的同源性。     

大豆细胞色素P450基因GmCYP78A69的克隆和生物信息学分析

干旱胁迫会影响大豆籽粒发育进而影响产量,但其中的机制尚不明确。本研究通过分析基因表达综合数据库(gene expression omnibus, GEO)中受到干旱胁迫的大豆芯片数据,筛选了3个响应干旱的细胞色素P450 (CYP450)基因,且三者均为CYP78A亚家族成员。该亚家族成员在多种植物中被证明参与种子大小的调控。在大豆品种‘齐黄34’中克隆了一个对干旱胁迫响应程度最大的CYP450基因GmCYP78A69。生物信息分析发现该基因含有CYP450家族蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测及跨膜结构域分析表明该蛋白定位于内质网,且通过一段跨膜结构域嵌入到内质网膜上。其高级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,含有少量的延伸链和β转角。在大豆不同组织中的表达分析表明该基因在各个器官中均有表达,其中在茎尖、花和幼荚中的表达量最高,推测该基因可能与花荚发育有关。本研究为探索GmCYP78A69在抗旱和种子形成等过程中的作用提供了基础,为研究干旱影响大豆种子大小的机制提供了切入点。     

一个与氰苷生物合成相关的植物CYP基因的克隆与表达分析

氰苷是由植物细胞色素P450单加氧酶(CYP)催化氨基酸生成的次生代谢产物,与植物的防御和抗逆境胁迫相关。为了获得蒜头果中与氰苷生物合成有关的CYP基因,本研究通过分析蒜头果转录组数据,从中分离并克隆得到1条细胞色素P450基因(命名为MoCYP79),并对其进行生物信息学分析及检测该基因在果实不同发育时期的具体表达情况。结果显示,MoCYP79基因的cDNA全长1632 bp,编码543个氨基酸;MoCYP79蛋白含有CYP家族的识别结构域血红素结合域(FSTGRRGC),且与巨桉(XP_010027351.1)、木薯(AAF27290.1,AAF27289.1)等植物CYP79蛋白聚在一支;MoCYP79基因在蒜头果花谢后的果实中表达量呈下降趋势,除发育3个月的果实外,该基因在其余的果实中的表达量均显著高于叶片,从大到小依次为花谢后的果实1个月>2个月>4个月3个月。本实验对研究蒜头果的对病虫害的防御、逆境胁迫的抵御及蒜头果中有效次生代谢产物的发掘具有重要的意义。     

石榴YABBY基因家族的生物信息学分析

YABBY基因家族是种子植物特有的转录因子,该家族具有N-末端锌指结构域和C-末端螺旋-环-螺旋保守结构域;在植物的生长发育,特别是叶片的生长、果实的发育、花器官的形成和植物次生代谢物质的代谢中起重要作用。本研究从石榴基因组中鉴定到6个YABBY基因,并将其划分为5个亚族。不同器官和品种的表达分析表明:Pg YABBY基因家族在石榴的生长发育和生理过程中起重要作用。转录组分析表明:PgYAB2可能负调控石榴果皮和种子的发育。PgINO有可能负调控外种皮的发育。PgFILb基因有可能通过调控木质素或半纤维素等次生代谢物质的生物合成相关基因的表达进而调控石榴籽粒的硬度。本研究结果为石榴YABBY家族基因功能研究、探索YABBY调控石榴果实发育及品质形成提供参考,为石榴的分子育种提供科学依据。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

石榴NAC转录因子家族的生物信息学分析

NAC (NAM-ATAF1/2-CUC2)是植物特有的转录因子大家族之一,其参与植物叶片的衰老、花的形成、种子的发育、根的发育、次生细胞壁的合成、激素的信号转导、果实的成熟及着色等生长发育过程。本研究基于石榴基因组数据库,从中鉴定了73个NAC基因;运用生物信息学方法分析NAC基因家族的蛋白理化性质、基因结构、保守结构域、进化和基因表达。结果表明,NAC基因可分为9个亚族。基于不同组织器官的转录组数据,分析了Pg NAC基因的表达模式,发现Pg NAC30有可能在石榴根系的发育中起重要作用;Pg NAC3和Pg NAC13有可能参与调控石榴种子大小,Pg NAC32有可能调控石榴果实成熟发育,Pg NAC49参与调控石榴种子木质素的生物合成。该研究结果为石榴NAC家族基因功能研究,探索NAC调控石榴果实发育及品质形成提供参考,为石榴的分子育种提供科学依据。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

星油藤WOX基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

本研究利用星油藤(Plukenetia volubilis L.)转录组及基因组数据库,通过本地BLAST,筛选到了9个星油藤WOX (PvoWOX)基因家族成员,并对它们编码的蛋白质氨基酸序列、分子量和等电点等进行了预测。通过构建系统进化树,将该基因家族成员分为3个进化支,分别为远古支、中间支和WUS支;进一步对PvoWOX家族成员的基因结构和蛋白保守结构域分析发现在同一进化支中均很保守,并且家族成员均含有保守的同源异型结构域,其中WUS支的成员都含有WUS-box结构域。利用转录组数据和qRT-PCR对PvoWOX基因家族成员在星油藤不同器官中的表达谱进行了分析,结果显示9个PvoWOX基因成员具有不同的表达模式,其中WUS支和中间支成员的表达具有组织特异性,而远古支成员则在不同的器官中均有表达。因此推测Pvo WOX家族成员具有功能多样性,分别参与调控星油藤不同器官的发育过程。本研究结果为进一步研究PvoWOX的生物学功能提供了帮助。     

金花茶黄烷酮3-羟化酶基因CnF3H的克隆及表达分析

本研究利用反转录PCR和RACE方法,从中国珍稀濒危植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的c DNA全长,命名为Cn F3H,Gen Bank登录号为HQ290517。碱基序列分析表明,该Cn F3H基因c DNA序列全长为1 360 bp,5'非翻译区(untranslated regions,UTR)长54 bp,3'UTR长202 bp,开放阅读框长为1 104 bp编码367个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,Cn F3H与茶(C.sinensis)F3H同源性高达99%。二级结构预测表明,无规则卷曲在Cn F3H蛋白结构中所占比例最大,其次为α-螺旋和延伸链。相对荧光定量PCR分析表明,Cn F3H基因的表达量在幼蕾期、初蕾期和膨大期的表达量较高,之后逐渐降低;Cn F3H基因在花器官不同部位中均有表达,其表达量高低顺序为雄蕊、花瓣、萼片、雌蕊和苞片。本研究为全面深入地研究金花茶花色形成的分子调控机理提供了充实的理论依据。     

14-3-3蛋白结构与功能预测及其在木薯成熟期的表达分析

为了深入研究木薯14-3-3蛋白结构和功能,也为研究木薯块根淀粉积累的分子调控提供新思路。本研究采用生物信息学方法对木薯14-3-3蛋白家族的组成成分与理化性质、系统发育进化、导肽、亚细胞定位、二级结构、功能结构域、三级结构及亲水性、疏水性进行分析和预测,并对14-3-3基因在不同木薯品种中进行差异表达分析。结果表明：（1）木薯14-3-3蛋白家族16个异构体存在多个不同的保守结构域,二级结构相似的亲水性蛋白家族成员在进化关系上可划分为2大不同的类别;（2）14-3-3基因家族16个成员在花叶木薯、ZM-Seaside和华南9号(SC9)块根成熟期的表达水平存在显著性差异(P<0.05),与花叶木薯和SC9相比,产量较高的木薯品系ZM-Seaside块根中14-3-3基因表达水平显著下降(P<0.05),推测14-3-3蛋白在木薯块根成熟期的淀粉积累过程中可能起着负调控作用。     

水稻肽链释放因子OseRF1-3基因克隆、表达及启动子分析

为了揭示水稻中肽链释放因子eRF1在蛋白质生物合成中的作用,对水稻eRF1基因的全长cDNA和启动子进行了克隆与表达模式分析。通过RT-PCR技术克隆获得1个水稻eRF1基因,命名为OseRF1-3,序列分析表明,该基因CDS序列全长1 308 bp,编码436个氨基酸,包含N、M、C共3个保守结构域。qRT-PCR结果表明,OseRF1-3是组成型表达,在水稻穗中表达最高。以水稻叶片基因组DNA为模板,通过PCR技术克隆了该基因起始密码子上游2 120 bp启动子序列,构建该基因启动子融合GUS植物表达载体,并通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织。GUS组织化学染色分析表明,OseRF1-3基因启动子驱动GUS基因在水稻各组织部位都表达即组成型表达,在根中表达较弱,在水稻花、硬壳中检测到GUS基因较强表达。GUS检测OseRF1-3基因启动子驱动GUS表达的结果与qRT-PCR得出的结果相一致。因此,该研究将为进一步探索OseRF1-3基因的功能奠定理论基础。     

甜荞FaesFUL4基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆的方法,从甜荞(Fagopyrum esculentum Moench.)品种‘北早生’中分离出调控果实发育的FaesFUL4基因,该基因的cDNA序列全长795 bp,包含一个长为714 bp完整的开放阅读框,共编码237个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析和同源蛋白比对结果显示:FaesFUL4蛋白属于A类MADS-box基因家族AP1/SQUA亚家族的euFUL进化系,含有MADS、I、K和C末端四个明显的结构域,且C末端转录激活区含有2个保守的模体(Motif):FUL motif和paleoAP1 motif。基因表达的组织特异性分析表明:FaesFUL4基因主要在甜荞叶片、花序和果实中表达,在根和茎中有微量表达,其在花序中的相对表达量最高。进一步分析基因在果实不同发育时期的表达量发现,其在果实迅速膨大期表达量最高。因此推测该基因不但参与调控花器官的发育过程,且对于维持果实的正常发育具有重要作用。     

巴西蕉果肉类黄酮生物合成特点及其关键酶基因的差异表达分析

为了明确巴西蕉果肉类黄酮生物合成的特点及其关键酶基因的差异表达特性,本研究选取抽蕾期(0 DAF)、断蕾期(20 DAF)、采收期(80 DAF)、成熟度Ⅱ期(8 DPH)、成熟度Ⅵ期(16 DPH)的巴西蕉的果肉,分别测量总黄酮的含量,观察其变化趋势。分别提取根、叶、花、果实以及上述五个时期的果肉RNA进行转录组测序,分析类黄酮生物合成关键酶基因在不同组织器官及不同发育成熟阶段的表达特性,并对其中10个关键酶基因的表达进行验证。结果表明从抽蕾期至断蕾期再到采收期,巴西蕉果肉黄酮含量呈明显的下降趋势,至采收时下降到最低点,在采后成熟过程中小幅上升再下降。类黄酮生物合成6个关键酶基因家族共78个基因在巴西蕉不同组织器官中是差异表达的,其中3个基因在根、叶、花和果实中都高水平表达,有42个、11个、18个、8个基因分别在根、叶、花、果实中高表达;这78个基因也在巴西蕉果实不同发育成熟阶段差异表达,有4个基因在果实发育成熟阶段都高水平表达,有27个、27个、19个、15个、9个基因分别只在抽蕾期、断蕾期、采收期、成熟度Ⅱ期和成熟度Ⅵ期中高水平表达;类黄酮生物合成关键酶基因CHS(Ma02_t24860.1)、CHI(Ma11_t21950.1)和F3'H(Ma03_t31570.1和Ma05_t26350.1)与总黄酮的变化趋势相似,推测这4个关键酶基因在香蕉果实黄酮生物合成过程中具有非常重要的作用。研究结果可为解析巴西蕉类黄酮生物合成的分子机制提供帮助。     

毛竹GMD基因家族全基因组鉴定与表达分析

GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase, GMD)是生物体内参与多糖合成代谢的一个重要基因。本研究利用毛竹全基因组和转录组数据信息,对GMD基因家族进行细致分析,共鉴定出39个家族成员。毛竹GMD各家族基因的理化性质有一定差异,但所含甘露糖4,6脱水酶结构域进化相对保守。进化树分析将毛竹GMD基因家族分为3大类。该家族基因上游启动子序列存在多种光响应、环境胁迫、激素应答等有关顺式作用元件。同源模建显示毛竹GMD为同源二聚体蛋白质,两个亚基均有相同或催化功能。转录组数据分析发现,部分成员GMD基因在竹笋生长阶段基因高表达特征明显,表明其可能参与笋的生长发育。另外,GMD的表达受到不同激素的影响。本研究通过对GMD基因的生物信息学分析,有利于进一步明确毛竹GMD基因的功能及其在岩藻糖生物合成途径中的作用。     

水曲柳WRKY40基因的克隆及表达模式分析

从水曲柳中克隆一个WRKY基因,序列比对后命名为Fm WRKY40,基因编码区全长为936 bp,编码331个氨基酸(GenBank登录号:KU928310);含有一个WRKY保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅱ类成员;分子进化分析表明,Fm WRKY40与芝麻WRKY40亲缘关系最近,蛋白相似性为73%;qRT-PCR表达模式分析表明:Fm WRKY40在干旱胁迫和ABA(脱落酸)胁迫下明显上调表达,该基因在水曲柳应答干旱和其他非生物胁迫中可能起重要的调控作用。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子At1g30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因At1g30210的全长读码框。多序列比对结果表明,在推导的氨基酸水平上,该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域,与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT-PCR实验结果表明,该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高,具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子Atlg30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因Atlg30210的全长读码框。多序列比对结果表明，在推导的氨基酸水平上，该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域，与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT—PCR实验结果表明，该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高，具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。