棉花油分合成相关基因的SSCP标记开发

本研究根据棉花油份合成相关基因(lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT; diacylglycerol acyltransferase,DGAT; phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)设计了75对引物,在8个棉花品种中运用SSCP技术...     

利用基因芯片技术筛选棉纤维伸长相关基因

从回交近交系(backcross inbred lines, BIL)群体中选取纤维长度差异较大的两个系NMGA-062 (33.03 mm)和 NMGA-140 (25.87 mm),利用Affymetrix棉花基因芯片,分析其开花后10 d (DPA, days post anthesis)棉纤维伸长相关基因表达谱。在24 029条转录本中,两材料间差异表达的转录本有7 282条,占总数的30.31%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3 993条,占筛选转录本总数的16.62%,功能分类表明这些转录本主要包括功能预测基因(15.57%)、翻译、核糖体结构相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换相关基因(9.29%)3大类。为了验证芯片数据的可信性,8个差异表达显著的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at, ACO1, ARF1, SAHH, TUA6, TUA7, β-tub1, β-tub10)被用于实时荧光定量PCR。两种检测手段表现出一致性。随后,利用实时荧光定量PCR对3个与棉纤维相关基因(ARF1, β-tub1, β-tub10)在纤维发育不同时期(5、10、15、20和25 DPA)的表达模式进行了研究,结果表明,3个基因在纤维伸长发育时期(10和15 DPA)大量表达,推测这3个基因可能与棉纤维伸长有重要关系。     

海岛棉 pepc 基因的克隆及序列和表达分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase)对植物生理功能行使重要的调节作用。本研究根据NCBI已公布的EST序列利用RACE和genome walking技术从海岛棉品种7124中克隆了一个新的pepc基因,命名为Gb.pepc3。该序列全长3259 bp,含有一个2910 bp的开放阅读框,编码969个氨基酸,推测分子量为110.7 kd,等电点为6.08 I。对Gb.pepc3蛋白的同源性比对和系统进化树分析显示,Gb.pepc3与已报道的其他植物的pepc相似性很高,属于C3型pepc。荧光定量PCR结果显示Gb.pepc3在棉花各组织中广泛存在,其中在胚中表达量最高,在纤维中表达量较低。在棉花发育各个阶段Gb.pepc3表达量不同,海岛棉在开花后15天Gb.pepc3表达量达到高峰期,而陆地棉开花后20天Gb.pepc3表达量达到高峰期。海岛棉和陆地棉间表达量差异明显。     

过表达AtNEK6转基因烟草的耐旱耐盐性研究

NEK6基因编码一种丝/苏氨酸蛋白激酶,具有调控植物细胞周期蛋白基因表达和乙烯信号转导的功能,与植物抵抗逆境胁迫相关。将拟南芥AtNEK6基因导入烟草,利用甘露醇和NaCl模拟干旱和盐胁迫环境对T2代转基因烟草进行研究。结果表明,在无胁迫处理条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重显著高于野生型;在干旱和盐胁迫条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重均极显著高于野生型,表现出较强的耐旱耐盐性;胁迫处理的转基因烟草叶片叶绿素荧光参数值(Fv/Fm)、SOD和CAT活性以及Pro含量极显著高于野生型,MDA含量极显著低于野生型,进一步证明了AtNEK6基因能够促进烟草的生长和提高转基因烟草对于干旱与盐碱的抵抗能力。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

cry2Ah-M基因杀虫活性研究

转Bt基因抗虫棉经过20多年的研究和生产应用,虽然取得了巨大的生态和经济效益,但棉铃虫的抗性风险也逐渐增加,因此,通过发掘不同杀虫机理的Bt基因,不仅可以提高杀虫效率,而且有效的避免或延迟昆虫的抗性。依据棉花遗传密码子偏好性,对来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)新型Bt基因cry2Ah-like进行了密码子优化改造,利用农杆菌介导法导入烟草。通过荧光定量PCR方法,Southern blot和Western blot方法,证明了转基因烟草中外源基因在RNA和蛋白水平上均稳定表达,并且已整合到烟草基因组中。生物活性检测结果表明,饲喂转基因烟草叶片4 d后,棉铃虫幼虫校正死亡率达86.59%,达到高抗水平,进一步证明密码子优化后的cry2Ah-M基因能够高效表达且具有较高的杀虫活性,是有效防治棉铃虫的新型基因。     

海岛棉pepc基因的克隆及序列和表达分析（英文）

 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase)对植物生理功能行使重要的调节作用。本研究根据NCBI已公布的EST序列利用RACE和genome walking技术从海岛棉品种7124中克隆了一个新的pepc基因,命名为Gb.pepc3。该序列全长3259 bp,含有一个2910 bp的开放阅读框,编码969个氨基酸,推测分子量为110.7 kd,等电点为6.08 I。对Gb.pepc3蛋白的同源性比对和系统进化树分析显示,Gb.pepc3与已报道的其他植物的pepc相似性很高,属于C₃型pepc。荧光定量PCR结果显示Gb.pepc3在棉花各组织中广泛存在,其中在胚中表达量最高,在纤维中表达量较低。在棉花发育各个阶段Gb.pepc3表达量不同,海岛棉在开花后15天Gb.pepc3表达量达到高峰期,而陆地棉开花后20天Gb.pepc3表达量达到高峰期。海岛棉和陆地棉间表达量差异明显。     

棉花纤维发育相关基因表达谱的比较分析

本研究通过3年4环境的田间试验,在BIL(backcross inbred lines)群体中选取断裂比强度最大的材料NMGA-062(32.5cN/tex)和断裂比强度最小的材料NMGA-144(26.67cN/tex),利用Affymetrix棉花基因芯片,比较分析NMGA-062和NMGA-144纤维发育10d时的基因表达谱。在24029条转录本中,两个基因型中差异表达的转录本6504条,占筛选转录本总数的27.07%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3461条,占筛选转录本总数的14.41%,对其进行功能分类。对8个差异表达明显的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10)进行实时荧光定量PCR的检测,发现表达模式均与芯片结果一致,说明芯片数据具有生物学意义上的可重复性,结果是可信的。本研究为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考。     

海岛棉GbHOX4基因荧光载体构建

 根据已公布的陆地棉GhHOX4序列设计适当引物,以海岛棉Giza75第一链cDNA为模板,用PCR方法,首次在海岛棉中克隆出GbHOX4的基因全长cDNA序列,用BamHI限制性内切酶酶切经改良带有绿色荧光蛋白标签的pBI121载体,构建了海岛棉GbHOX4基因荧光载体。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。