一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

一株小反刍兽疫病毒的分离鉴定与生长曲线测定

将含高滴度小反刍兽疫病毒的新鲜病料研磨后接种VERO DS细胞系进行病毒分离,出现细胞病变后连续传代,取3代以上培养物,进行RT-PCR和间接免疫荧光试验及生长曲线测定。生长曲线测定分别以0.01和0.1 MOI接种VERO DS细胞,每隔12h测定病毒滴度,连续培养168h,绘制病毒生长曲线,分析生长特性。结果显示,病料接种细胞72h后,出现细胞病变,经RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为小反刍兽疫病毒?;生长特性研究显示,0.01和0.1 MOI两种病毒接种量,病毒滴度最高均为106 TCID50左右,但峰值出现时间和下降速度存在差异,0.01 MOI接种量出现峰值晚,但是维持高滴度时间较长。本文成功分离一株小反刍兽疫病毒,并对两种接毒量的生长特性差异进行了初步分析,为探索该病毒培养方法和收毒时间提供了借鉴。     

我国小反刍兽疫疫情现状与防控策略

小反刍兽疫作为重要的跨境动物疫病之一,已经传入我国并广泛流行。对我国养羊业、民生和经济发展造成沉重的打击。为有效防控该病,从小反刍兽疫的病原学、宿主范围,传播特点、传播因素和综合防控的策略等方面进行了概述,重点从制度保障和防控要素方面进行分析,旨在为我国小反刍兽疫的防控提供理论支持。     

新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

壳寡糖抗氧化性及对鲫鱼保鲜性能的研究

[目的]研究壳寡糖的抗氧化性及壳寡糖对冷藏鲫鱼保鲜性能的影响.[方法]以壳寡糖为原料,采用邻二氮菲-Fe2氧化法、DP-PH法等对壳寡糖的抗氧化性进行了测定,以pH、TVB-N及TBA为指标研究了壳寡糖对鲫鱼保鲜性能的影响.[结果]研究表明,1.5mg/ml壳寡糖溶液的还原能力相当于50 μg/ml阳性对照VC的还原能力;1 mg/ml壳寡糖溶液对羟自由基的清除率为45％,相当于100μg/ml阳性对照VC对羟自由基的清除率;4 mg/ml的壳寡糖溶液对DPPH自由基的清除率达到97.8％.新鲜鲫鱼在4℃冰箱冷藏条件下,壳寡糖溶液涂膜处理组和对照组在第8天时的TVB-N值分别为252.0和196.0 mg/kg;pH分别为7.73和6.69;TBA值分别为1.552和0.670.综合各项指标的变化,壳寡糖涂膜保鲜的鲫鱼货架期明显比对照组长,表明壳寡糖具有较好的抗氧化能力和保鲜性能.[结论]研究可为壳寡糖在更多领域更广泛的开发应用奠定基础.     

心水病病原体高度保守基因合成与原核表达

通过软件DNAStar分析,设计合成心水病病原体抗原性、保守性比较高的一段基因,长度为564bp,将它插入pUC57载体,再转入pET-32a质粒中进行原核表达并纯化表达产物。结果表明,合成的基因在大肠杆菌中得到高效表达并能简易地提纯,纯化的表达产物有望用于心水病免疫学检测;此合成外来基因还可以作为心水病病原PCR检测的阳性对照。这些工作为我国建立心水病防控技术储备奠定了一些基础,也为防控高度危险性外来传染病提供一种安全和可行的研究新思路。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

小反刍兽疫病毒分子生物学与疫苗研究进展

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是小反刍动物一种重要的传染病,是世界动物卫生组织规定的A类传染病,在我国被列为一类动物疫病,具有很高的发病率和死亡率,该病的广泛流行,给世界养羊业造成了巨大的损失。特别是该病2007年第一次在我国报道后,更应加强对它的研究。文章主要叙述了小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)分子生物学的研究情况,特别是主要基因特征和结构蛋白的功能,并对小反刍兽疫疫苗的使用和最新研究进展进行了总结。     

实时荧光RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株和野毒株

为快速鉴别小反刍兽疫病毒的疫苗株和野毒株,本研究通过分析Gen Bank中已发布的小反刍兽疫病毒全基因组序列,设计了1对通用引物以及疫苗株和野毒株特异性探针各1条,建立了小反刍兽疫病毒鉴别实时荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对疫苗株和野毒株的检测灵敏度均可以检测至10拷贝/反应,在108至101拷贝/反应之间具有良好的线性关系,扩增效率均接近1。该方法具有良好的特异性,能够区分不同谱系的野毒株株和疫苗株。使用该方法对136份临床疑似样品检测,检出的阳性数量与普通RT-PCR相同,并且测序后的区分结果也相同。本方法的建立为该病的实验室鉴别检测和流行病学调查提供了技术支持。     

内蒙古和西藏自治区野生反刍动物小反刍兽疫监测

为了解小反刍兽疫疫情在野生反刍动物中的流行情况,在风险较高且野生动物集中分布的内蒙古自治区赤峰市、呼伦贝尔市和兴安盟以及西藏自治区日喀则地区、山南地区、阿里地区和那曲地区,平行采集棉拭子样品和血清样品各78份。通过RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸,同时用竞争ELISA检测反刍野生动物血清中的小反刍兽疫病毒特异性抗体。结果检测样品中未发现阳性样品。说明该批次样品中没有发现野生动物感染小反刍兽疫病毒。研究结果可为小反刍兽疫防控工作提供依据。