牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒H120株和H52株种毒的制备与鉴定

鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株种毒由中国兽医药品监察所制备和供应,种毒的保存期为10年,为了保证种毒的质量和供应,需要定期制备种毒。将H120株、H52株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养,收获鸡胚尿囊液,与50 g/L牛乳蔗糖溶液等体积混匀,进行分装和冷冻真空干燥。对其进行剩余水分测定、真空度测定、病毒含量、安全性、免疫原性、纯净(无菌检验、支原体检验、外源病毒)和特异性检验,检验结果表明,各项检验均符合规定。同时为了区分H120株、H52株种毒,用实验室已建立的RT-PCR和酶切方法对2种种毒进行鉴别检验,结果表明能准确区分H120株和H52株种毒。试验结果为疫苗生产提供了能长期保存且稳定性好、高滴度的生产用种毒,也可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。     

新型生物制剂与枯草芽孢杆菌联用对肉鸡生产性能及抗生素使用量的影响

本试验旨在研究新型生物制剂与枯草芽孢杆菌联用对肉鸡生长性能及肉品质的影响。采用单因子完全随机设计,将8 580只1日龄罗斯308白羽肉仔公鸡按照体重分成2个处理组,每个处理组10个重复。试验组饮水添加新型生物制剂与枯草芽孢杆菌,而对照组鸡饮水不添加以上产品。试验期共42 d。结果显示,试验组与对照组各阶段的日采食量、料重比及21日龄日增重差异均不显著(P0.05),而胸肌肉色(b*)、腿肌pH24 h差异显著(P0.05),21日龄成活率、胸肌pH24 h、腿肌肉色(b*)、剪切力、滴水损失差异极显著(P0.01)。因此,新型生物制剂与枯草芽孢杆菌联用更利于肉鸡饲养,完全可以代替抗生素,为家禽绿色健康养殖提供了一种新的饲养理念。     

血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究

从山东某疑似感染禽腺病毒的发病鸡群中采集病料并分离到一株禽腺病毒,克隆纯化后进行PCR检测和序列分析,鉴定该毒株为血清4型禽腺病毒,命名为GY株。用LMH细胞繁殖的GY株病毒滴度可以达到107.5 TCID₅₀/0.1mL,并建立了纯净稳定的种子批。动物致病性试验结果显示,攻毒鸡只8/10死亡,剖检均出现心包积液,肝脏肿大、出血或坏死,表明该毒株为强毒株。就攻毒途径、攻毒剂量等方面研究发现,GY株经胸部肌肉注射后发病率和发病时间相对颈部皮下注射途径更有优势,确定攻毒途径为肌肉注射;通过比较不同剂量(5×10^3.0~5×10^6.0 TCID50)GY株病毒攻击SPF鸡的致病性,将攻毒剂量定为5×10^5.0 TCID₅₀。研究表明,GY株可作为禽腺病毒4型攻毒用强毒株。     

鸡腺病毒12个血清型代表毒株Penton蛋白基因分析

为了解鸡腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）Penton基因的遗传进化规律,试验根据GenBank中已公布的各基因型序列设计特异性引物,通过PCR技术分别扩增12个血清型毒株的Penton基因,连接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上进行序列测定,并将12个血清型毒株Penton蛋白的核苷酸序列与NCBI上已公布的标准毒株的核苷酸序列使用ClustalW法进行分析比对,绘制遗传进化树。结果显示,12种血清型Penton蛋白核苷酸序列与各血清型标准毒株同源性均在99.2%以上,其中FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10、FAdV-11与对应标准株同源性高达100%,这进一步证实了实验室保存毒株与世界相应标准毒株的一致性。Penton蛋白虽然保守性较高,但不同种之间仍存在明显差异。FAdV-A1与其他种毒株同源性为70.6%~73.3%;FAdV-B5与其他种毒株同源性为70.6%~77.9%;FAdV-C同种不同血清型之间核苷酸同源性为99.6%,FAdV-C4与其他种之间同源性71.2%~73.4%;FAdV-D同种不同血清型之间核苷酸同源性为95.6%~98.7%,与其他种之间最高为85.3%;FAdV-E同种不同血清型之间核苷酸同源性为98.2%~99.4%,不同种间最高为85.3%。即相同种毒株之间差异较小,不同种毒株之间差异较大。依据Penton蛋白的核苷酸序列同样可以将FAdV分为A、B、C、D、E 5个种。本研究通过成功克隆FAdV 12种血清型Penton基因,并进行遗传进化分析,为今后对FAdV诊断、监测及毒株鉴定提供了参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒和A亚群禽白血病病毒共感染对疫苗免疫鸡生长性能和免疫器官的影响

禽为分析不同免疫状态下禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)和A亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV-A)共感染对鸡生长性能及免疫器官的影响,通过对 1日龄和 10日龄常规疫苗免疫鸡群、1日龄灭活疫苗免疫鸡群、1日龄活疫苗免疫鸡群进行REV与ALV-A单感染或共感染,于不同日龄称重,采集免疫器官,对生长性能、免疫器官比重进行比较和分析。结果显示,1日龄鸡单感染或共感染REV和ALV-A均会引起发病、死亡及体重下降,REV、ALV-A单感染组及共感染组平均病死率依次为27.6%、11.6%及31.9%,表明,疫苗免疫刺激增强了REV与ALV-A感染的致病性。10日龄鸡REV、ALV-A单感染及共感染于81日内病死率分别为13.3%、6.7%及20%,低于1日龄感染各相应组,体重下降程度也低于 1日龄感染鸡,表明鸡的日龄越高对REV、ALV-A感染的抵抗力越强。活疫苗与灭活疫苗免疫的比较显示,两种疫苗免疫应激均能引起鸡体重下降明显,且活疫苗免疫对体重的抑制作用更明显。REV单感染和共感染对生长发育的抑制作用高于ALV-A单感染,尤其是共感染对鸡体重的抑制作用最明显。对免疫器官比重的影响方面,1日龄感染时,共感染组胸腺比重显著降低,10日龄感染影响不显著,表明鸡日龄越大对病毒感染的抵抗力越强;常规免疫可引起法氏囊比重下降,但对法氏囊的影响是可恢复的,而REV单感染和共感染会加重常规免疫对法氏囊的损伤,且损伤更持久或不可恢复;ALV-A单感染对法氏囊的损伤影响不明显;单感染和共感染对脾脏比重的影响均不显著。本研究为深入研究REV和ALV-A单感染或者共感染诱导鸡群发生免疫抑制机制积累了重要的实验数据。     

禽腺病毒12个血清型代表毒株的分子生物学鉴定研究

为建立和完善禽腺病毒(FAdV)标准毒株库,针对FAdV不同种的纤突(Fiber)和六邻体(Hexon)序列设计引物,对中国兽医药品监察所保藏的FAdV 12个血清型代表毒株进行PCR扩增和遗传进化分析,完成了对毒株的分型鉴定,再结合同种不同血清型病毒Hexon序列上酶切位点的特征,用酶切法验证了毒株不存在同种中不同血清型之间的交叉污染。试验结合遗传进化分析和酶切法对FAdV 12个血清型毒株进行了系统分型鉴定,明确其遗传背景、血清型信息及纯净性,建立了系统完整的FAdV代表毒株毒种库,为FAdV鉴定及相关生物制品的研发和评价奠定了物质基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒MD-2株感染性克隆的构建与突变分析

为构建禽网状内皮组织增生症病毒(REV)MD-2株的感染性克隆,将MD-2株的前病毒基因组全长克隆至pMD18-T Simple载体中构建MD-2全长质粒,经转染CEF细胞后进行病毒拯救及鉴定,并对拯救病毒进行了生物学特性研究。结果表明,成功构建了MD-2全长质粒,拯救病毒感染CEF细胞后用间接免疫荧光试验检测到病毒抗原;拯救病毒的生长特性与亲本病毒相比无明显差异。随后对env基因进行了多个位点的定点突变,并拯救出相应的突变株,结果显示env基因第1433位碱基突变后不能拯救出病毒,推断1433位的突变为致死性突变。MD-2株感染性克隆的构建和病毒拯救的研究为继续研究REV基因和蛋白功能提供了技术支持。     

初探先秦时期的古代茶文化

直至今天,茶文化仍然是我们整个文化体系中的重要组成部分。而在整个茶文化体系中,不仅包含了茶叶生产、加工制作,同时也融入了饮茶过程中的相关内涵和规范。先秦时期指的是在秦朝以前的历史时期。秦朝是我国封建时代的开始,先秦时期主要是从伏羲开始到春秋战国时期。因此,本文着重研究的是这一时期的茶文化内容。深度研究茶文化就需要充分结合相应的记载来探寻茶文化存在的实证。本文拟从已经出土先秦时期的与茶相关的实物入手,结合已经出土的与先秦时期茶及茶文化相关的物品,从而研究先秦时期茶文化的有关内容。     

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体的间接ELISA检测方法,应用原核表达的IBDV VP2蛋白作为包被抗原,经方阵试验确定间接ELISA试验的最佳反应条件：包被抗原的浓度为8 μg/mL,标准阴、阳性血清的稀释度为1:400,封闭液选用10 %马血清,酶标抗体最佳稀释倍数为1:15000,最佳抗原稀释液为0.01 M PBS(PH 7.2);抗原最佳包被条件为4 ℃过夜,待检血清和酶标二抗反应条件为37 ℃ 60 min,底物作用时间为15 min。待检血清的OD450nm≥0.288判为阳性,反之判为阴性。特异性试验、敏感性试验和重复性试验结果显示,该方法的特异性好、敏感高、重复性好。用建立的间接ELISA方法与商品化IDEXX-ELISA试剂盒对临床血清样品进行检测,符合率为93.5 %。该方法的建立为检测IBDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、方便经济的检测方法,为鸡传染性法氏囊病免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。