苹果锈果类病毒火焰海棠分离物全基因组克隆及序列分析

【目的】检测从山东青岛采集的有"花脸"症状的火焰海棠(Malus‘Flame’)果实是否带有苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)。【方法】提取带有"花脸"症状的火焰海棠果皮总RNA,设计ASSVd特异性引物,利用RTPCR方法进行检测。设计基因特异性引物扩增ASSVd基因组全长,并进行克隆、测序,利用CLC RNA Workbench4预测其二级结构。用DANMAN软件比对来自中国不同地区、不同寄主的苹果锈果类病毒分离物基因序列。用MEGA-7软件分析山东火焰海棠ASSVd分离物与来自不同国家、不同寄主ASSVd分离物的遗传关系。【结果】从山东青岛采集的表现"花脸"症状的火焰海棠果皮中检测到ASSVd,推测火焰海棠果皮的"花脸"症状可能由ASSVd引起。利用基因特异性引物克隆4条ASSVd基因组全长序列,其长度为333～334 bp,在GenBank的登录号依次为MK102981-MK102984。ASSVd序列比对结果显示,来源于不同寄主的分离物存在差异。系统进化树显示ASSVd不存在明显的地区专化性,进一步对ASSVd二级结构分析发现不同寄主的ASSVd致病区(P)存在明显的差异。【结论】从山东青岛采集的带有"花脸"症状的火焰海棠果实带有ASSVd。本研究从火焰海棠检测到ASSVd,明确其为自然寄主之一,且火焰海棠果实的"花脸"症状形成可能与ASSVd侵染有关。     

苹果LRR-RLK基因家族鉴定和表达分析

【目的】从苹果全基因组中鉴定LRR-RLK家族蛋白成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究苹果LRR-RLK的潜在功能提供理论基础。【方法】利用BLASTp基于GDR数据库鉴定苹果LRR-RLK家族成员,通过ExPASy Proteomics Server、Cell-PLoc、CD-Search Tool、MEGAX、MG2C等软件分析LRR-RLK蛋白序列基本信息、亚细胞定位情况、结构域组成、系统进化关系以及染色体定位情况。利用实时荧光定量PCR技术检测苹果12个LRR-RLK的组织表达和诱导表达特性。【结果】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,这些LRR-RLK蛋白包括318—1 827个不等的氨基酸残基,等电点分布在5.16—9.75。亚细胞定位结果显示LRR-RLK蛋白均定位在细胞膜。系统进化分析可将其分为15类,各亚家族基因数量分布在1—111。染色体定位结果显示,LRR-RLK在苹果17条染色体上均有分布,其中第7条染色体数量最多,为40个。LRR-RLK家族基因具有2个特定的保守结构域,分别是LRR结构和蛋白激酶结构。蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,β-转角所占比例最小。通过定量检测发现筛选的12个家族成员在各组织中均有表达（除MD00G1105400外）,且多数基因在茎中表达水平相对较高。低温条件下,7个基因上调表达,其中MD09G1153800上调最明显,最高为对照的6.8倍,而MD06G1170200和MD05G1061600均下调表达;在干旱条件下,8个基因上调表达,其中MD00G1105400上调最明显,最高为对照的9.6倍;在盐胁迫条件下,MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800始终处于上调表达状态,其中MD02G1071800上调最明显,最高为对照的14.9倍。苹果新梢接种轮纹病菌后,12个LRR-RLK家族基因表达基本上呈先上升后下降的趋势。并且在‘望山红’中,1 d时表达水平较高,而在‘鸡冠’中,3 d时表达水平较高。MD09G1153800和 MD05G1065800在‘鸡冠’响应轮纹病菌侵染过程中显著上调表达,而在‘望山红’中无响应,可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。【结论】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,进化上可分为15组,在17条染色体上均有分布,多数基因具有在茎中高表达的组织表达特征,多数基因受逆境和轮纹病菌调控。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Aclin基因的克隆和序列分析

蜱，隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目，寄生于动物体表，以吸食动物血液为生。蜱广泛分布于世界各地，侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类，乃至两栖类等多种动物。蜱和其所携带的病原微生物，如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等，对动物和人类的健康造成严重危害。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

苹果NLP（Nin-Like Protein）转录因子基因家族全基因组鉴定及表达模式分析

【目的】探究苹果NLP转录因子全基因组特征与表达模式,以便更深入地了解其结构特点与作用机制。【方法】基于本地BLAST数据库和Pfam数据库两大数据库,运用blastp和hmmsearch两种查询策略,对苹果全基因组范围内的NLP转录因子家族成员进行鉴定。经过严格筛选与确认后,对搜索结果进一步展开分析,主要分为3部分,包括NLP蛋白分析、NLP分析与苹果NLP表达分析,其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre ²、WoLF PSORT、STRING等程序或软件用于蛋白质分析,基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在线工具,对于苹果NLP表达情况利用qRT-PCR进行定量检测。【结果】从苹果全部蛋白数据库中共筛选出6个NLP成员,系统进化分析可将它们分为I、II、III三类;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,占比最小的是β-转角;亚细胞定位预测均定位于细胞核中,符合转录因子的特征;染色体定位显示5个基因（MDP0000584547除外）定位于4条染色体上;启动子分析发现大量与激素和逆境响应相关的顺式作用元件,暗示它们可能参与到激素和逆境信号的调控过程中,此外还识别到一个响应氮的GCN4作用元件,进一步说明该类转录因子与氮素有密不可分的关系;通过定量检测揭示苹果NLP家族在茎、叶等组织高表达的特征模式,并且表达分析结果也证实苹果NLP响应氮饥饿、干旱胁迫等。【结论】通过对苹果全基因组的分析,共识别6个NLP转录因子,对6个基因的结构与蛋白保守域分析,发现它们之间具有极高的相似性、保守性,同时又存在差异。类比拟南芥NLP蛋白的关联网络,推测与拟南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有复杂的功能。