在大肠杆菌内高效表达大分子量拟蜘蛛牵丝蛋白

依据已报道的蜘蛛(Nephilaclavipes)牵丝蛋白部分cDNA序列,设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体,大小分别为360和390bp。多聚化得到8倍体和16倍体后,克隆到表达载体pET-30a,得到4种表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Westernblot检测,表达产物呈梯度排列,主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800mg/L。     

人乳铁蛋白转基因研究进展

人乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的糖基化蛋白，可可逆性地结合两个铁离子。概述了人乳铁蛋白的结构和理化性质，以及乳铁蛋白基因的结构，并着重论述了人乳铁蛋白转基因研究的状况和主要研究成果。在此基础上，提出了尚未解决的问题，并展望了人乳铁蛋白转基因研究的前景。     

Clenbuterol诱导载酯蛋白D在猪脂肪组织中表达加强

Clenbuterol(CLB,盐酸克伦特罗),俗称瘦肉精。由于其在动物体内广泛残留,可能导致食用此类产品的人中毒而被禁止使用,但已有研究表明该制剂可显著减少猪脂肪沉积,因此,对其分子机制进行深入研究将具有重要的理论与实践价值。本研究通过对家猪饲喂高剂量clenbuterol(≥1.5mg/kg体重),提高瘦肉率10%左右。通过实时荧光定量PCR技术对脂肪组织中与脂类代谢密切相关的4个基因研究发现,饲喂clenbuterol的猪脂肪组织内载酯蛋白D(apolipoprotein D,apoD)mRNA丰度增加超过2倍,而脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,lpl)、硬酯酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,scd)和激素敏感脂酶(hormone sensitive lipase,hsl)mRNA丰度变化不明显。因此,推断clenbuterol通过改变部分脂代谢关键基因的表达来实现减少脂肪积累。载酯蛋白D可能是CLB应答基因之一。     

蛋肉鸡遗传资源开发与利用相关产业发展状况研究报告

1蛋肉鸡遗传资源保护、开发与利用的基本情况 1.1西方发达国家在蛋肉鸡遗传资源保护、开发与利用方面的基本情况 1.1.1在遗传资源保护方面走在了世界的前列 1.1.1.1组织机构健全 从全国性的畜禽种质资源保护与利用委员会,到专门化的畜禽保种委员会;从国家级的保种中心(基因库),到地方各级的保种基地;从全国畜禽种质资源信息中心,到各保种基地的信息网点,形成了上下连接,左右联动的人流、物流和信息流,使全国的保种工作处于十分有 序的状态.     

家禽血液基因组DNA的快速提取

[目的]建立一种应用硅胶膜提取禽血DNA的新方法。[方法]应用硅胶膜法和传统的酚/氯仿法提取抗凝禽血基因组DNA,设计合成了一对2.7 kb的鸡卵清蛋白基因的引物,检测这2种方法提取的基因组DNA模板对聚合酶链式反应（PCR）扩增效率的影响。[结果]用硅胶膜法提取的基因组DNA产量和质量均比传统的酚/氯仿法高,将该法提取的基因组DNA作为模板能够消除抗凝剂对后续PCR反应的影响。[结论]硅胶膜法为快速提取高质量的禽血基因组DNA奠定了基础。     

中国牛科主要饲养品种朊蛋白基因种系发生分析

朊蛋白基因编码蛋白的具体生理功能还不清楚,但脑组织细胞中朊蛋白(PrPc)的异常构象形式(PrPc)的累积会引起传染性海绵体脑炎的发生.对于类似的蛋白构象病,与传统分类方法相比,以其基因序列进行种系发生分析将能够为该病种间(或品种间)的传播屏障的预测提供更为可靠的依据(van Rheede et al.,2003).     

λgtl0 cDNA文库表达序列标签测定时模板处理方式

表达序列标签是揭示基因组容量的有效方法。在构建cDNA文库的基础上，对以λgtl0为载体进行表达序列标签到定时模板的处理方法进行了探讨。结果表明，以λ噬菌体DNA为模板直接测序比PCR产物经回收后为模板进行测序，其目标克隆的平均插入片段长度要长，但反应成功率低。以λ噬菌体浸提液为模板进行PCR并在产物回收后进行测序反应，可能是以λ噬菌体为载体构建文库的表达序列标签测定的最佳选择。     

λgt10 cDNA文库表达序列标签测定时模板处理方式

表达序列标签是揭示基因组容量的有效方法.在构建cDNA文库的基础上,对以λgt10为载体进行表达序列标签测定时模板的处理方法进行了探讨.结果表明,以λ噬菌体DNA为模板直接测序比PCR产物经回收后为模板进行测序,其目标克隆的平均插入片段长度要长,但反应成功率低.以λ噬菌体浸提液为模板进行PCR并在产物回收后进行测序反应,可能是以λ噬菌体为载体构建文库的表达序列标签测定的最佳选择.     

Loxp序列位置对基因表达的影响

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因（egfp）作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶（phytase）基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因（egfp）为试验基因,红色荧光蛋白基因（dsred2）为内参基因。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）。以pEGFP-N2质粒为对照质粒,以pDsRed2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶（phytase基因）基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因（luciferase基因）为表达内参基因。以pIREsNEo、pGEM-5zf-loxp和pT-phytase、pGL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）和p-SV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列）等试验质粒,以egfp基因(pEGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞,同时设置一个转pEGFP-N2+ pDsRed2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平（活性）进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因,对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著,表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响,转染前质粒的电泳结果表明,各质粒间不同构象的质粒比例基本一致,这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响,对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值（代表各转染的egfp基因表达水平）进行的统计分析表明,同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著,不同结构的转染间存在差异,其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于pEGFP-loxp和pEGFP-N2,而pEGFP-loxp和pEGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响,在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响,为了进一步验证上述结果的可靠性,本研究以植酸酶基因作为另一试验基因,以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因,以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证,验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接,实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中,以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时,则内源基因的下游为最佳的打靶位点。     

成纤维生长因子(FGF2)和成纤维生长因子受体(FGFR1)在新生死亡体细胞克隆牛组织中的表达

为了探讨成纤维生长因子及其受体在克隆动物出生死亡以及器官发育异常中的可能作用,本研究用荧光定量RT—PCR技术分析了成纤维生长因子基因（FGF2）及成纤维生长因子受体基因（FGFR1）在来自2种供体细胞（成年成纤维细胞和胎儿成纤维细胞）的出牛死亡克隆牛的6个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑）中的表达。结果表明：FGFR1的表达在来自两种供体细胞的体细胞克隆牛的心脏（P〈0．05）和肝脏（P〈0．05）显著升高,FGF2基因在体细胞克隆牛组织中的表达未发现异常。由于FGFR1在胚胎发育和器官形成中起重要作用,所以FGFR1的异常表达可能是造成克隆动物出生死亡以及器官发育异常的原因之一。