pH值、灭菌条件和凝固剂对马铃薯组培苗生长的影响

为改善马铃薯组培苗的生长状态,本试验以Favorita组培苗为材料,研究培养基pH值、凝固剂和灭菌条件对马铃薯植株生长的影响。结果表明,在120℃灭菌20 min的培养基上,植株生长较好。培养基pH值为5.5时,植株最高,叶片数最多。植株在5.0 g/L车前子胶的培养基上生长健壮,干物质积累量最多。车前子胶培养基的渗透压最高,其凝胶强度仅为琼脂培养基的36.14%。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

利用RNAi技术抑制马铃薯类受体激酶基因(StRLK)表达的研究

植物类受体蛋白激酶(Receptor-like protein kinase,RLK)是蛋白激酶的一个亚家族,参与植物的信号转导,在植物生长发育、抗病等过程中起重要作用。在前期研究中自二倍体马铃薯高抗青枯病基因型ED13中获得了类受体蛋白激酶基因StRLK。利用StRLK基因的特异区段,以pUCCRNAi为中间克隆载体、pCHF1为植物表达载体,构建了该基因的RNA干扰载体pCHF1-StRLK。进一步以ED13的茎段为外植体,利用农杆菌介导法将pCHF1-StRLK导入ED13中,获得了5株再生植株。用CaMV35S启动子特异引物对5株再生植株进行PCR扩增,均得到大小约500 bp的特异性条带,初步证明pCHF1-StRLK成功转入ED13。以ED13为对照,利用StRLK基因的特异引物对这5株再生植株进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因的表达在5个转基因植株中均受到了不同程度的抑制,说明导入的pCHF1-StRLK发挥了干扰活性,且干扰效果与基因的插入位点有关,为进一步研究StRLK基因的功能提供依据。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒s(PVS)总RNA为模板，通过RT—PCR获取长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核表达质粒pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获得的抗血清可用于大田马铃薯s病毒的快速检测。     

大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定

 以我国优良的大白菜自交系‘85-1’为材料,利用pIndigoBAC-5为载体,通过对高分子量DNA的制备、大片段DNA的选择、连接转化条件等几个方面的优化,构建了大白菜细菌人工染色体文库。该文库由57 600个克隆组成,平均大小为98.4 kb,空载率为1.5%;覆盖大白菜基因组10.3倍;挑取6个克隆培养5 d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。大白菜细菌人工染色体文库的构建为重要功能基因的克隆和定位及比较基因组研究奠定了基础。     

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。     

石麦15细菌人工染色体文库构建与鉴定

为给小麦功能基因研究提供参考信息,以冬小麦栽培品种石麦15(Triticum aestivum L.)为试材,从暗培养7~10d的黄化幼苗地上部提取高分子量基因组DNA,使用载体pCC1BAC的HindⅢ位点构建了六倍体小麦细菌人工染色体文库。该文库由1 000 000个以上克隆组成,保存在1 020个混合池中,克隆插入片段平均大小为85kb,空载率为2.5%;覆盖小麦基因组5倍以上;挑取7个克隆培养5d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。石麦15细菌人工染色体文库的构建为小麦基因克隆、调控序列克隆以及比较基因组学研究奠定了基础。     

基于双目立体视觉的植株生长状态无损监测方法的研究

基于双目立体视觉的植物生长状态无损测量方法研究,能快速地对植株生长进行无损监测,尤其能准确测量倾斜生长的植株高度,对于农业工程研究有重要意义。本研究在实验室搭建计算机双目立体视觉平台,对大豆植株生长进行无损监测。由于植物的形态与生长条件限制,双相机光轴与基线的夹角未能构成最佳双目测量系统,因此本研究对双目立体视觉平台本身的精度进行了校验。利用VC＋＋6.0编制的图像分析处理软件,结合界跟踪算法与斜率计算对植株的顶芽进行识别,能取得很好的效果。研究表明,实验表明双目立体视觉可应用于植物无损监测,具有广阔的应用前景。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用内切酶BglⅡ和EcoRⅠ将PVY-cp基因自pGEM-pvy切下,定向插入到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的表达质粒pBV220的启动子Pr、Pl的下游,构建了该基因的原核表达载体pBV-pvy。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明:PVY-cp基因在大肠杆菌HB101中经温度(42℃)诱导后,可特异地高效表达大小约30KD蛋白。Western印迹杂交进一步鉴定了该表达蛋白确为PVY外壳蛋白。     

应用GAR-HRP进行甘薯病毒NCM-ELISA检测试验

分别采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 (GAR -HRP)和碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体(GAR -AP) ,对甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)、甘薯轻斑驳病毒 (SPMMV)及甘薯褪绿病毒(SPCFV)进行NCM -ELISA检测 ,结果表明 ,采用GAR -HRP进行NCM -ELISA检测对于SPFMV、SPLV、SPM MV、SPCFV同样有效 ,且特异性高 ,重现性好 ,在某些方面优于GAR -AP。对于国内危害甘薯的SPFMV、SPLV等主要病毒 ,采用GAR -HRP进行ELISA检测更加经济有效 ,是切实可行的