两个棉花ß-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析

β-葡聚糖酶是一类能降解β-葡聚糖的水解酶。本研究分别通过电子克隆和棉纤维发育cDNA文库筛选法克隆到2个棉花β-葡聚糖酶新基因,内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(GhEG,GenBank登录号为HM462003)和1,3-β-葡聚糖酶基因(GhGLU,GenBank登录号: HM462004)。GhEG全长ORF为1 581 bp,编码526个氨基酸残基。GhGLU全长ORF为1 410 bp,编码469个氨基酸残基。基因组水平分析表明,GhEG含5个内含子和6个外显子,而GhGLU无内含子,仅1个外显子。新克隆的2个基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝,而在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝。通过开发SNP标记分别将GhEG和GhGLU在四倍体中的一个拷贝定位在第19染色体和第4染色体上。Q-PCR表达分析表明,GhEG在根、茎、叶中表达水平很低,而在纤维伸长期优势表达,在15 DPA和20 DPA纤维中,该基因在海岛棉海7124中的转录本显著高于陆地棉TM-1。GhGLU在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因,特别在根、纤维发育初始期和伸长后期优势表达,且表达水平在陆地棉TM-1和海岛棉海7124间也有显著差异。     

用于区别不同棉花品种基因组特征的微卫星位点筛选

保守性强、重复性好、多态性高的微卫星位点可被有效用于构建作物DNA条形码。选取目前生产上主要推广种植、代表不同来源系统的12个棉花品种作为微卫星位点筛选材料,参考我室构建的四倍体栽培棉种种间高密度遗传图谱信息,从376对覆盖全基因组的SSR引物中,筛选出51对引物可扩增出带型清晰且多态性高的微卫星位点。这些引物在12个供试品种中共产生155个等位位点,每对引物揭示的等位基因位点在2~7之间,平均值为3.04。参照微卫星位点的染色体定位和多态信息,在每条染色体上选择一个多态性相对高的SSR位点,其相应的26对SSR引物被推荐为构建棉花品种DNA条形码的一套首选引物,并初步应用于12个品种的DNA条形码编制。其余25对引物作为候选引物。使用该套引物扩增出的微卫星位点可用于大量棉花品种DNA条形码构建,为棉花品种真实性和纯度的分子鉴定奠定基础。     

陆地棉背景下海岛棉第18染色体片段置换系的培育及相关农艺性状QTL定位

Sub18是以陆地棉遗传标准系TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体的置换系材料。本研究以TM-1为受体亲本, 置换系Sub18为供体亲本, 借助分子标记辅助选择技术培育了一套以TM-1为背景, 含海岛棉3-79第18染色体不同长度片段的置换系。这套置换系由45个株系构成, 共78个置换片段。其中27个株系导入单片段, 占总株系的60%; 9个株系导入2个片段, 占20%; 9个株系导入3个及以上片段, 占20%。导入片段总长度为467.6 cM, 约为该染色体遗传长度的4倍, 每个株系内被替换的染色体片段长度不完全相同, 平均遗传长度为5.99 cM, 最短的为0.9 cM, 最长的20.35 cM。其中13个株系表现开放花蕾性状, 涉及的最短导入片段长5.05 cM。对TM-1、Sub18以及培育的45个导入系进行农艺性状调查和QTL联合定位分析, 鉴定出纤维强度(qFS-C18-1)、整齐度(qFU-C18-1)、马克隆值(qFMi-C18-1)、成熟度(qFMa-C18-1)、皮棉重(qLW-C18-1)、籽指 (qSI-C18-1)和衣分 (qLP-C18-1) 7个加性QTL和5个上位性效应QTL。研究结果为进一步精细定位目标QTL、克隆QTL以及重要性状分子设计育种奠定了基础。     

棉花抗逆育种研究进展

随着全球水资源短缺、土壤盐渍化、频繁的极端天气等威胁,以及粮棉争地矛盾的日益突出,对棉花耐逆能力的要求越来越高。本文综述了非生物逆境胁迫条件下棉花的抗逆性反应,棉花抗逆种质资源发掘、利用和分子育种研究进展,并提出棉花抗逆育种研究中存在的问题及未来棉花抗逆育种研究发展方向。     

棉花溶血磷酸酯酰转移酶(LPAT)家族基因的发掘和表达分析

棉花油脂合成相关代谢在控制油分形成、纤维发育等进程中起着重要作用。溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂代谢过程中的一个关键酶。本研究利用雷蒙德氏棉全基因组数据库,通过生物信息学技术,鉴定并获得8个棉花LPAT家族基因的全序列和染色体定位等信息。通过序列比对进行系统进化和分类分析,明确这8个家族基因分布在6条染色体上,分为4亚类,其中第I类和第III类中各含2个基因、第II类1个、第IV类3个。组织表达分析表明这8个基因在棉花营养和生殖阶段均表现表达多样性。LPAT6和LPAT8在17 d胚珠中表达水平很高,推测在油脂合成代谢调控中起重要作用。8个LPAT基因均在纤维中优势表达,其中LPAT2、LPAT3和LPAT4表达水平更高,推测LPAT家族基因的表达参与棉纤维发育进程。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用

以陆地棉CLA1基因为标记基因,利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)载体建立基于病毒介导的棉花基因沉默体系(virus-induced gene silencing, VIGS)。病毒RNA2的RT-PCR分析证明,棉花子叶接种TRV病毒后,该病毒可高效扩散到受体的根、茎、叶等器官。利用TRV-VIGS体系同时诱导34份不同来源棉花材料CLA1基因沉默,尽管不同材料间的抑制程度有差异,但均可有效抑制CLA1基因的表达,说明该体系在棉花研究中的广谱利用性。GhMAPKKK基因受黄萎病菌诱导表达, 接种后96 h表达量达到高峰。利用TRV-VIGS体系,成功抑制了棉花GhMAPKKK基因的表达,与对照株相比,抑制后的棉花植株接种黄萎病菌后更易感病,说明GhMAPKKK参与了棉花对黄萎病菌的抗性反应。具有广谱性、灵敏性和高通量等特点的棉花TRV-VIGS体系建立将加速棉花功能基因组研究进程。     

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针, 通过电子克隆方法, 结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a (GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp, 编码618个氨基酸, 与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝, 其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13~19 DPA的纤维中, 其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记, 将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087), 表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。