不同毒性玉米大斑病菌侵染对感病玉米叶片PAL活性的影响

利用从自然界中分离纯化的156株玉米大斑病菌菌株中筛选得到的强毒菌株YC和弱毒菌株01-23T分别接种感病玉米叶片,测定玉米叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的动态变化。结果表明,与不接种对照相比,接种强毒菌株YC 1~2 d时,玉米叶片PAL活性显著降低;接种3~4 d时,PAL活性略有上升但差异不显著;接种5 d时,PAL活性又显著降低。接种弱毒菌株01-23T 1~2 d时,玉米叶片PAL活性略有降低但差异不显著,接种3~5 d时,PAL活性上升但差异仍不显著。PAL是玉米抵抗玉米大斑病的一种重要防御酶,在侵染初期,只有降低玉米叶片的PAL活性玉米大斑病菌才能达到成功定殖的目的,可为明确玉米大斑病菌致病性的生化机制提供一定理论依据。     

转基因克隆牛外源基因整合位点的研究

整合位点的侧翼序列是外源基因表型研究和功能探讨的前提条件,对目的基因的正常转录和表达有着重要影响。本试验利用热不对称交措式PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR）的方法克隆了目的基因。结果表明：外源基因整合到牛的12号染色体基因组克隆(NW_003104315.1)中。分析了整合位点的纯合性发现转基因牛为整合位点杂合子。TAIL-PCR法能够有效、快速的鉴定外源基因在基因组中的整合位置,具有良好的应用前景。     

玉米大斑病菌NAD(H)激酶蛋白的鉴定及分析

NAD(H)激酶是NADP(H)从头合成途径的关键物质,对生物体的生长、发育具有重要作用。本研究以稻瘟病菌中3个NAD(H)激酶蛋白为查询序列,搜索玉米大斑病菌蛋白质组序列库,结果发现在玉米大班病菌中均有同源序列,分别为127652、103052和163223。利用生物信息学的方法对3个基因的结构进行分析,结果表明只有163223为断裂基因,包含5个外显子和4个内含子,127652和103052为单外显子;163223和103052呈现酸性,而127652则呈现碱性;103052为稳定蛋白,而另两者为不稳定蛋白;通过高级结构分析发现这3种蛋白在N端一侧α螺旋较多,C端一侧延伸链和β转角较多,并且这3种蛋白质有2个在结构和功能上的相似的结构域。     

研究生分子生物学实验教学中创新能力的培养

分子生物学实验技术已经成为生命科学研究的重要工具。在分析高等农业院校研究生培养目标的基础上,将探究型模式用于河北农业大学研究生的分子生物学实验教学实践中,对教学模式、实验内容、方法、考核和实验室管理等方面进行改革,建立了合理的实验教学体系,旨在培养动手能力强且具有创新精神的高素质人才。     

Bowman-Brik胰蛋白酶抑制剂在水稻叶片生长和种子萌发过程中的表达

Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂(BBTI)是一类富含半胱氨酸的丝氨酸蛋白酶抑制剂,广泛分布于豆科、禾本科和菊科植物中,在蛋白质存储和植物防御中具有重要作用。水稻(Oryza sativa L.ssp.indica)BBTI家族具有13个成员,其中BBTI-9和BBTI-10都为假基因。其余BBTI成员都存在数量不同的保守Bowman-Birk结构域。为了解BBTI的表达信息,本研究主要通过设计多肽序列的方法,制备了11个BBTI的多克隆抗体,利用Western blot技术检测其在叶片生长发育和种子萌发过程中的表达。结果表明BBTI在叶片生长过程中呈现不同的时空特异性表达,BBTI-1、-2、-11、-12和-13伴随叶片生长含量增加,BBTI-5、-6和-8在苗期表达含量高,而BBTI-3、-4、-7在苗早期1cm时表达量达到峰值,以修饰或多聚体的形式在叶片生长过程中表达。在种子萌发过程中发现BBTI-8在种子中表达量较高,萌发后2h降到最低,24h后一条分子量略小的降解带开始表达,其余抗体在种子萌发阶段未发现有明显的变化。本研究还统计了苗期叶片、分蘖期叶片和萌发期的种子的MPSStags数据,试图比较转录与蛋白质水平对应关系。本研究结果证明,BBTI蛋白质在水稻生长发育过程中存在差异表达,为深入了解其功能提供了重要线索。     

玉米大斑病菌分生孢子形成的影响因素及GATA转录因子家族的表达分析

【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。本研究旨在确定影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素;明确GATA家族成员基因在分生孢子形成时期的表达特征,为深入解析调控病菌发育及致病的分子机制打下基础。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为试材,探索13种不同培养基(乳糖酪蛋白琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆琼脂培养基、玉米叶片葡萄糖琼脂培养基、玉米叶片琼脂培养基、玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基、玉米籽粒琼脂培养基、玉米粉葡萄糖琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基、查氏培养基、基本培养基、水琼脂培养基)、5种碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖)、以乳糖酪蛋白琼脂培养基为基础培养基,以5 g·L~(-1)的量分别添加不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH_4Cl、KNO_3、(NH_4)_2SO_4、NH_4NO_3)、pH(4、5、6、7、8、9)、温度(15、20、25、30、35℃)及光照强度(1 500、3 000、6 000、9 000 lx)等条件对分生孢子产量的影响;进一步利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析病菌菌丝形成时期和分生孢子形成时期GATA家族5个成员基因的表达量。【结果】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素,发现产孢量最大的培养条件为玉米叶片葡萄糖琼脂培养基,碳源为乳糖,培养温度为25℃,pH 8,光照条件为光暗交替各12 h,光照强度为6 000 lx。另外,还发现在培养基中添加KNO_3可显著提高分生孢子产量。对GATA家族5个基因的相对表达水平分析表明,与菌丝时期相比,在分生孢子形成时期GATA2的表达量明显上调,其他基因(GATA1、GATA3、GATA4、GATA5)表达量均显著下调。【结论】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的最佳培养条件;根据GATA家族5个基因相对表达分析结果,推测GATA2可能参与了玉米大斑病菌的分生孢子形成。     

棉花黄萎病抗菌肽25a2的生物信息学分析

25a2是从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中分离出来的一个棉花黄萎病抗菌肽。利用生物信息学工具分析了抗菌肽25a2的氨基酸序列,预测其信号肽、跨膜区、理化特征、结构域、二级结构、三级结构等性质。结果显示,该蛋白属于分泌蛋白,其序列包含位于N端的一个信号肽和位于C端的一个跨膜区。25a2的二级结构以自由卷曲为主,属于混合型蛋白,三级结构为一个致密的球状。以上特征表明该抗菌肽最可能的作用机制是＂地毯＂模式。     

玉米大斑病菌StPEX11基因家族的鉴定及生物信息学分析

PEX11基因家族成员是参与过氧化物酶体增殖调控的关键因子。在玉米大斑病菌基因组中鉴定出2个PEX11基因,根据其相对分子质量分别命名为StPEX11-1和StPEX11-2。利用生物信息学方法,对基因结构、蛋白质的保守结构域及理化性质进行分析,预测其二级结构域。系统发育树分析发现,玉米大斑病菌的2个StPEX11基因分别属于I型和III型的PEX11亚家族。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的表达特性分析及其调控基因的筛选

【目的】确定玉米大斑病菌转录因子StSte12在基因组中的位置,分析目的蛋白质StSte12的结构特征;明确StSTE12在病菌不同发育时期的表达情况;筛选可能受StSte12转录因子调控的基因,分析其匹配序列的结构特征,并比较它们在病菌的中表达情况。【方法】利用生物信息学方法,确定StSte12在玉米大斑病菌基因组中的位置并解析目的蛋白质StSte12的结构特征;利用Western blot技术分析StSTE12在病菌不同发育时期的表达规律;根据酿酒酵母Ste12转录因子的下游调控基因,筛选病菌中可能受StSte12调控的功能基因;并利用生物信息学方法得出下游调控基因的结合位点;利用RT-PCR技术,分析这些基因在StSTE12 RNAi转化子与野生型菌株中的表达情况。【结果】StSTE12的 ID为105656,该基因位于scaffold_13正链的1061747-1064127位置;该蛋白具有Ste12-like蛋白特有的保守结构域（STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构）及空间结构;StSTE12在附着胞时期表达量最大;筛选了部分StSte12调控基因,与StSte12的匹配序列为T\C GAAAC A\G,中间部分GAAAC非常保守;StKAR5在野生型中表达量小于StSTE12 RNAi转化子,StBEM2、StBUD8、StCHS7相反;StRAX2的表达量在野生型和转化子中一致。【结论】StSte12具有Ste12-like所特有的DNA结合结构域和空间结构;该蛋白在附着胞发育中发挥重要功能;筛选了部分StSte12的调控基因,其匹配序列可概括为T\C GAAAC A\G,且证实了这些基因受StSte12调控。     

玉米大斑病菌STK2的基因组定位、蛋白质结构预测及其表达

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌 GS115 中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;成功构建了STK2的真核表达载体pPIC9K-STK2,筛选获得了抗性转化子;在毕赤酵母菌中,经甲醇诱导得到了1个分子量约为41 kD的蛋白质组分且被分泌至胞外,该蛋白质的大小与理论分子量相符,推测Stk2蛋白已在宿主菌中表达并被分泌至胞外。【结论】玉米大斑病菌STK2位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,属于典型的MAPK蛋白激酶;该基因能在真核细胞中表达,获得了可溶性分泌蛋白质,为Stk2蛋白的多克隆抗体制备及基因的功能研究奠定基础。