玉米大斑病菌转录因子StSte12的活性及其对酵母生长的功能互补分析

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录激活活性;酵母互补试验表明,StSTE12可以回复酿酒酵母ste12Δ的功能,能够调控酵母细胞的生长。【结论】玉米大斑病菌StSTE12属于STE12-like基因;转录因子StSte12具有转录活性;对酵母细胞在YPD培养基上的侵入生长有重要的调控作用。     

碳源对StSte12基因调控玉米大斑病菌生长和分生孢子发育的影响

以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为碳源分别培养玉米大斑病菌野生型和St Ste12基因RNAi阳性转化子,研究碳源对St Ste12基因调控玉米大斑病菌菌丝生长和分生孢子发育的影响,为阐明St Ste12基因的功能和病菌的致病机制奠定基础。结果表明,St Ste12基因对玉米大斑病菌菌丝生长和分生孢子发育均有重要的调控作用,St Ste12基因的表达量下降后,菌丝的生长势变弱,颜色变浅,生长速度显著下降,产孢量显著降低。4种供试碳源中,可溶性淀粉对St Ste12基因调控菌丝生长和发育的影响最大,蔗糖最小;乳糖对St Ste12基因调控分生孢子发育没有显著影响,而其他3种碳源的影响均达到显著水平。     

百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究

【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。     

Ste12基因对玉米大斑病菌渗透胁迫的调控作用

前期研究表明,玉米大斑病菌Ste12基因对分生孢子发育和致病性有重要的调控作用。本试验利用Ste12基因的RNAi沉默突变体StRNAi 9-10和StRNAi 3-6分析该基因对玉米大斑病菌渗透胁迫的调控能力。通过比较野生型菌株和RNAi沉默突变体在0.4mol/L CaCl2、1mol/L KCl、1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇等渗透胁迫条件下的菌落形态、生长速度、菌丝形态、产孢量等指标,发现StRNAi9-10对1 mol/L NaCl和1mol/L KCl胁迫的耐受能力显著增强,对1mol/L CaCl2胁迫的耐受能力显著降低,对1mol/L山梨醇的耐受力无显著差异;StRNAi 3-6对4种胁迫条件的耐受能力均显著降低。以上研究结果表明,Ste12基因不仅调控玉米大斑病菌的分生孢子发育和致病力形成,而且参与玉米大斑病菌的渗透胁迫调控。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

寄生疫霉菌侵染拟南芥相关microRNA靶标调控网络分析

【目的】分析寄生疫霉菌侵染胁迫下拟南芥表达的microRNA,为探明microRNA对应靶标基因的调控网络及其可能的病理学和生物学功能奠定基础。【方法】以寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,鉴定在病菌侵染胁迫下拟南芥表达的microRNA,构建其靶标调控网络,并进行Gene Ontology和蛋白质结构域富集分析。【结果】在寄生疫霉菌侵染拟南芥的Solexa测序文库中鉴定39条拟南芥microRNA,筛选出了5个转录因子相关的调控网络;Gene Ontology富集结果表明,在生物学过程中,转录调控相关的基因显著富集;蛋白质结构域富集结果表明,靶基因中转录因子显著富集。【结论】拟南芥响应寄生疫霉菌microRNA靶标基因的功能主要集中在转录因子的调控功能上。     

基因芯片分析芜菁雌蕊退化突变体tpa及野生型开放花的转录组差异

 【目的】基于转录组水平分析芜菁雌蕊退化突变(turnip pistil aborted, tpa)发生的可能原因,为揭示芸薹属作物雌蕊发育的分子遗传调控机制提供研究依据。【方法】 利用tpa及其野生型植株的开放花制备的mRNA反转录成cDNA与拟南芥ATH1芯片进行杂交,筛选出在tpa及其野生型植株中表达有差异的基因,并利用RT-PCR技术对芯片筛选出的基因进行验证。【结果】获得了152个在野生型(W1)和完全退化株(M3)转录组中差异表达的基因,61个在W1和部分退化株(I2)转录组中差异表达的基因,以及24个在I2和M3转录组中差异表达的基因,上述差异基因分别属于细胞壁合成与调控、防卫与胁迫反应、转录调控、蛋白质代谢以及普通新陈代谢等9个不同的功能类别。通过对41个基因的RT-PCR验证,获得了At2g42840、At1g57750、At5g20630、At2g03090、At3g08030、At5g08000、At2g28790、At5g63310和At2g24270等9个在tpa及野生型植株中具显著不同的时空表达特性的基因。【结论】 拟南芥cDNA 芯片可用于分析tpa及其野生型基因的转录差异,筛选获得的9个显著差异基因不但在雌蕊发育等生殖发育过程起重要作用,还参与了植物营养生长的生理生化过程。     

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株,并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况,为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子,利用融合PCR融合克隆片段,构建Hac1i随机插入表达盒;再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列,融合克隆片段,构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体,通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子,荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒,利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株,经PCR初步验证,得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2~4d后,可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号,表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。     

玉米大斑病菌Homeobox转录因子家族全基因组鉴定及其表达规律分析

【目的】从全基因组水平上鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Homeobox转录因子家族及其分布,阐明该家族的序列及进化特征,分析该家族基因在病菌不同生长发育时期的表达规律。【方法】利用生物信息学手段搜索玉米大斑病菌全基因组数据库,鉴定Homeobox转录因子家族;采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析;利用在线工具GSDS(gene structure display server)(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图;利用Clustal X 1.83软件分析Homeobox保守结构域(HOX保守结构域)的氨基酸序列特征;利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)对Homeobox蛋白的二级结构进行在线预测;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析Homeobox转录因子家族在病菌不同发育时期的表达模式。【结果】在玉米大斑病菌中鉴定了8个Homeobox转录因子家族成员(St HTF1-8),根据基因结构及系统进化特征将其分为4类;亚细胞定位预测分析表明,这8个蛋白全部定位在细胞核中;该家族成员均含有HOX保守结构域,其二级结构具有特征性的"螺旋-转角-螺旋"(helix-turn-helix)结构;利用q RT-PCR技术对该家族成员在菌丝、分生孢子形成、芽管形成、附着胞及侵入丝形成等5个时期的表达规律分析,发现不同基因在病菌不同发育时期具有不同的表达水平,其中St HTF1在菌丝发育、分生孢子及附着胞形成等3个时期的表达水平相对较高,St HTF3、St HTF4在分生孢子形成时期表达水平最高,St HTF6在芽管形成时期的表达水平最高,St HTF2、St HTF5、St HTF7和St HTF8在附着胞形成时期的表达水平均较高。【结论】玉米大斑病菌包括Homeobox转录因子家族包含8个成员,在进化上分为4大类,全部成员均分布在细胞核内,其编码蛋白质均含有保守的HOX结构域及"螺旋-转角-螺旋"空间结构;该基因家族成员在病菌不同发育时期呈现不同的表达规律。     

‘月月粉’月季NAC家族全基因组鉴定及皮刺发育相关成员的筛选

【目的】从‘月月粉’月季全基因组中鉴定NAC家族成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究‘月月粉’NAC的潜在功能提供理论基础,筛选可能参与皮刺发育的候选基因。【方法】以拟南芥NAC氨基酸序列为参考,利用双向Blast及HMM结构域检索筛选RcNAC;对筛选成员进行理化性质、亚细胞定位、序列特征、顺式元件和系统进化分析;基于已释放转录组数据,分析RcNAC在不同组织器官,和不同逆境处理条件下的表达特性;同时通过‘月月粉’不同发育阶段皮刺组织转录组测序,筛选与皮刺发育可能相关的RcNAC。【结果】共鉴定得到116个RcNACs,均含有完整典型的NAM保守结构域,其编码蛋白包含69—713个氨基酸,等电点从4.43—9.54,分子质量从7.87—79.99 kD,81个RcNACs被预测定位于细胞核内;115个RcNACs在7条染色体上不均匀分布,1个RcNAC未明确位置信息;系统进化树分析将AtNACs、OsNACs和RcNACs聚为21类;在不同组织器官中,116个RcNACs表达模式各异,遭受水胁迫和感染灰霉病之后,31个RcNACs表达量发生变化;在衰老的花组织中,6个RcNACs表达量上升;皮刺转录组数据中检测到53个RcNACs,其中26个RcNACs为差异表达基因。【结论】基于已有转录组数据分析,RcNACs协同调控植物组织发育及逆境胁迫响应;结合皮刺转录组数据,部分成员可能参与皮刺细胞增殖、次生细胞壁生物合成及细胞程序性死亡等过程,可作为皮刺发育相关候选基因进行深入研究。     

DHN黑色素与玉米大斑病菌附着胞膨压形成的关系

 【目的】探讨玉米大斑病菌胞内DHN黑色素在附着胞膨压产生过程中的作用,明确玉米大斑病菌的侵入机理。【方法】通过诱导玉米大斑病菌附着胞产生,确定附着胞形成的最佳条件,利用溶质排斥技术及incipient-cytorrhysis技术对玉米大斑病菌野生型菌株01-23和黑色素缺失突变体△St3hnr附着胞细胞壁孔径大小和膨压进行测定。【结果】野生型菌株01-23细胞壁孔径范围是2.1—2.7 nm,膨压在5.4 MPa左右;黑色素缺失突变体△St3hnr细胞壁孔径范围是2.7—3.3 nm,膨压在4.1 MPa左右;缺乏黑色素的附着胞不能形成高膨压,丧失了穿透能力。【结论】黑色素层对溶质分子外渗的阻挡作用导致了附着胞高膨压的产生,膨压产生的机械穿透力在玉米大斑病菌穿透基质平面的过程中发挥了重要作用。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

特异性MEK抑制剂U0126对玉米大斑病菌孢子萌发、附着胞产生和致病性的影响

 【目的】研究MAPK信号转导途径对玉米大斑病菌生长、发育和致病性的调控作用，为明确玉米大斑病菌和玉米之间互作的分子机制奠定基础，对玉米大斑病的有效防治也有重要的理论意义。【方法】利用MEK特异性抑制剂U0126处理玉米大斑病菌，观测该抑制剂对玉米大斑病菌孢子萌发、附着胞发育和致病性的影响。【结果】U0126对玉米大斑的菌落形态和生长速度没有显著影响，可以形成正常的菌丝、分生孢子，但分生孢子萌发时间晚，芽管短，分生孢子萌发百分率和附着胞产生数目下降，玉米叶片的发病时间延迟2～3 d，发病率下降30%左右。在一定浓度范围内，U0126对分生孢子萌发和附着胞产生的抑制程度随着浓度增加而上升，但随着处理时间的延长而下降。【结论】玉米大斑病菌的分生孢子萌发、附着胞产生和对感病玉米叶片的致病能力受U0126抑制的MAPK信号转导途径调节。     

东亚飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性与功能研究

 【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条几丁质酶基因的时空表达特性存在明显差异,其中LmCht6主要在表皮表达;LmCht6的RNA干扰试验表明：2龄飞蝗注射dsLmCht6后,其几丁质酶基因LmCht6表达量明显降低;飞蝗从2龄到3龄的龄期转化过程中,表现为发育延迟,新表皮与旧表皮无法完全分离,导致死亡率达到72.2%。【结论】东亚飞蝗拥有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异;LmCht6在飞蝗蜕皮过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡。     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立

【目的】从全基因组水平鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的MAPK超家族基因,并对其进行系统进化、基因结构、多重序列比对及保守位点分析,构建玉米大斑病菌中的MAPK级联途径模型,为深入研究该植物病原菌中MAPK级联途径的功能奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过基于隐马尔科夫模型的HMMER 3.0软件搜索基因组,鉴定并获得MAPK超家族成员序列、基因组定位信息;采用MEGA 5.0软件进行系统进化分析;通过GSDS工具进行基因结构分析;利用ClustalX、MEME工具分析MAPK蛋白激酶区的保守性及保守位点。【结果】在玉米大斑病菌基因组中发现了4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。系统进化分析将MAPK分为Kss1/Fus3、Slt2、Hog1及Ime2 4类;MAPKK分为Pbs2、Ste7及Mkk1 3类;MAPKKK分为Ste11、Bck1及Ssk2 3类。基因组定位及基因结构分析表明,MAPK超家族散布在基因组中,且MAPK基因的结构最为复杂多样,MAPKK次之,MAPKKK结构最简单。多重序列比对与保守位点分析表明,玉米大斑病菌MAPK超家族的激酶结构域均高度保守,其中MAPK具有保守的“-TxY-”磷酸化位点,MAPKK含有保守的“-SD[V/I]WS-”磷酸化位点,MAPKKK含有“-G[S/T][V/P][F/M][W/Y]M[A/S]PEV-”特异性保守位点。【结论】全基因组分析表明,玉米大斑病菌中包括4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。通过系统进化、基因结构及多重序列比对和保守位点分析,在玉米大斑病菌中构建了Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog和Ime2-homolog 4条MAPK级联途径,其中Ime2 homolog为一条新发现的MAPK级联途径。该信息为深入解析植物病原真菌MAPK超家族的功能奠定了基础。