苹果赤霉素信号转导因子MdGAMYB的克隆和表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,从其短枝顶芽中克隆得到1个赤霉素信号转导因子MdGAMYB,对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,MdGAMYB的开放阅读框(ORF)长度为1 656bp,编码551个氨基酸,蛋白质分子量为59.741 kD。生物信息学分析表明MdGAMYB编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点;序列分析表明,Md GAYMB和其他物种的GAMYB蛋白有很高的相似性,均含有保守的R2R3 DNA结合域和GAMYB家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域;系统进化分析表明,Md GAYMB与梨、梅花、草莓、枣和葡萄等的GAMYB蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Md GAYMB具有组织表达特异性,在叶片、花和芽中的表达量较高。外源GA3处理抑制了花芽孕育和翌年成花,抑制MdGAMYB的表达。在易成花品种‘烟富6号’中的表达量高于难成花品种‘长富2号’。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种发生于禽类的病毒性传染病。笔者以杂交瘤技术研制抗AIV共同抗原的特异单克隆抗体，旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法快速检测AIV，以便为A型AIV的快速诊断技术的研究提供理论依据。     

应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

利用禽流感H9亚型病毒(AIV-H9)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经免疫荧光试验(IFA)检测,以研制抗禽流感病毒(AIV)单克隆抗体。结果获得了5株特异性抗AIV核蛋白(NP)的单克隆抗体细胞株,分别命名为AIV-NP-2C3、AIV-NP-6A5、AIV-NP-3H9、AIV-NP-7B4、AIV-NP-2H4。这5株单克隆抗体能与所有试验的AIV-H9病毒反应,Western blotting方法鉴定结果表明,单克隆抗体仅识别60 ku的蛋白抗原,而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示,以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ELISA方法可迅速检测出禽流感病毒,这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。     

克伦特罗残留检测试剂盒条件的优化及其应用

以CL-OVA为包被抗原,抗克伦特罗单克隆抗体为一抗,组建检测克伦特罗的竞争EL ISA试剂盒。以方阵滴定确定包被抗原最佳浓度(0.72μg.孔-1),抗克伦特罗单克隆抗体(2F12)最佳稀释度(1∶2 000),并建立EL ISA标准曲线,确定最小检测量为0.25 ng.mL-1。用该方法检测动物模型仔猪尿样中的盐酸克伦特罗,结果表明:停药后第1~7天尿样均为阳性,2周后有少量猪仍为阳性,而阴性对照猪尿样均为阴性。这表明建立的试剂盒对克伦特罗残留的检测具有广阔的应用前景。     

新型环形病毒AGV7 VP3基因克隆、表达及其多抗制备

研究对新型环形病毒AGV7 VP3基因进行了克隆、表达以及多克隆抗体的制备。利用原核表达系统获得了可溶性重组GST-VP3蛋白,纯化后免疫小鼠制备了抗GST-VP3多克隆抗体。同时构建pcDNA3.1+EGFP-VP3真核表达载体。通过共聚焦显微镜观察发现,AGV7 VP3与EGFP融合蛋白在HCT116肿瘤细胞中集中表达于细胞核,且呈散在点状分布,类似凋亡小体。研究为进一步研制AGV7血清学诊断方法提供了材料,同时为探究AGV7VP3的生物学功能打下了基础。     

鸡白介素8的克隆表达及其生物趋化性研究

鸡白介素8(cIL8)是9E3/CEF4基因编码的一种诱导型趋化因子。用RT-PCR方法,从鸡胚胚体总RNA模板中扩增cIL8的cDNA序列,测序后,将cIL8基因分别克隆入pGEX-6p-1载体和pFastBacI载体进行表达。利用SDS电泳分离原核表达的cIL8融合蛋白,制备鼠抗cIL8血清,并与昆虫细胞表达的cIL8进行免疫荧光(IFA)反应,同时对雏鸡外周血单个核细胞(PBMC)进行生物趋化试验。结果成功扩增了cIL8基因的cDNA序列,在大肠杆菌和昆虫细胞中均能表达,制备的鼠抗cIL8血清能与昆虫细胞表达的cIL8反应。重组cIL8在一定浓度范围内,可使PBMC发生趋化作用,最高趋化指数为4.38±0.49,且是典型剂量依赖的钟形趋化性反应曲线。本研究结果为cIL8的功能研究和探讨马立克氏病病毒类白介素8(vIL8)的生物学作用奠定了基础。     

K亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

研究分别将K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的gp85基因以及env基因分别克隆到原核表达载体pColdⅠ以及真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后分别命名为pCold-K-gp85以及pcDNA3.1-K-env。pCold-K-gp85转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现,该Gp85重组蛋白主要表达在包涵体中。利用纯化后Gp85重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了抗ALV-KGp85蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光以及Westernblot试验进一步证明,所获得的抗Gp85蛋白的多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-K-env质粒以及感染ALV-K的DF-1细胞内表达的Env蛋白。以上研究结果为进一步探究ALV-K宿主范围,细胞受体鉴定及亚群特异性诊断技术研究奠定了基础。