马立克氏病病毒类白细胞介素8(vIL-8)的生物趋化作用

利用杆状病毒表达系统,将病毒源性趋化因子病毒类白细胞介素8(vIL-8)基因克隆入转移载体pFastBacI,然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组,通过重组子转染Sf9细胞得到含vIL-8的重组病毒rBacvIL-8。间接免疫荧光试验和雏鸡T、B淋巴细胞生物趋化分析结果表明,vIL-8在昆虫细胞中得到了表达,重组vIL-8在一定浓度范围内,可使鸡T、B细胞发生趋化作用,最高趋化指数分别为3.31±0.50和4.02±0.48,且是典型剂量依赖的钟形趋化性反应曲线;进一步分析发现vIL-8对B细胞趋化活性较对T细胞强?P<0.05),提示vIL-8对靶细胞的趋化性与病毒感染过程相关,在早期溶B细胞感染中有重要作用。     

鸡CTLA-4蛋白在昆虫细胞中的表达及其单克隆抗体的制备

旨在制备鸡细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性单克隆抗体,为家禽免疫检查点和疫苗研发提供有益制剂。利用杆状病毒表达系统体外表达鸡的CTLA-4蛋白,以其为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,经B淋巴细胞融合技术制备、筛选出针对鸡CTLA-4蛋白的单克隆抗体。通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、流式细胞术等方法分析抗CTLA-4单克隆抗体的生物学特性。结果显示：构建了在Sf9昆虫细胞中表达CTLA-4蛋白的重组杆状病毒,成功筛选出3株能稳定分泌抗鸡CTLA-4蛋白的单克隆抗体,分别命名为：mAb-CTLA4-3D7、mAb-CTLA4-5A4、mAb-CTLA4-6A12。亚类鉴定表明,mAb-CTLA4-3D7为IgG2a, Lambda链;mAb-CTLA4-5A4为IgG3,Kappa链;mAb-CTLA4-6A12为IgG2a, Kappa链。3株单克隆抗体均能与转染真核表达质粒pCAGGS-CTLA-4-Flag的DF-1细胞和感染重组杆状病毒rBac-CTLA-4的Sf9昆虫细胞反应。单克隆抗体mAb-CTLA4-3D7与鸡的PBMC有较好的结合活性,且能与CD3<...     

鹧鸪鸡伤寒沙门氏菌感染的诊断与防治

某鹧鸪养殖场饲养10 000只鹧鸪,240日龄发病,临床症状表现为病鹧鸪采食量突然下降,精神不振、羽毛蓬松杂乱、粪便呈稀白色,病程持续近一个月,死亡鹧鸪约200只.共送检30只,剖检病理变化主要为肝肿大、质地极脆易破裂,其中60%肝呈土黄色,20%血液稀薄,80%盲肠内有硬泥块样物质,20%眼周皮下水肿,30%肾肿大、有出血,30%泄殖腔有白色粪便.根据病史调查、症状观察、病理剖检、细菌分离以及染色镜检、生化试验、血清型鉴定一系列试验,诊断为由鸡伤寒沙门氏菌感染所引起的细菌性疾病.同时根据药敏试验结果对发病群进行治疗,使病情得到迅速控制,为该病的防治积累了一定的经验.     

一株鹅源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列测定

2017年10月,安徽六安某朗德鹅养殖场鹅群出现精神沉郁,采食下降,陆续死亡。对送检病死鹅组织观察,可见肝脏肿胀、质脆、颜色变淡,脑组织水肿、充血、出血。将脑组织研磨后接种SPF鸡胚进行分离病毒。收集死亡鸡胚尿囊液、离心后进行电镜负染发现直径约为40 nm的病毒粒子。利用黄病毒E蛋白基因特异性引物进行的RT-PCR以及序列分析证明该分离株为黄病毒属坦布苏病毒,命名为AHRD2018。将AHRD2018株全基因组进行PCR分段扩增、克隆、测序发现,AHRD2018全基因组全长为10 992 bp。AHRD2018株全基因组与国内鸭源坦布苏病毒分离株同源性最高可达97.7%,处于同一进化分支;与鸽源TMUV同源性为96.7%;与鹅源TMUV同源性为96.7%左右。这一鹅源坦布苏病毒的分离及其全基因组的测定为进一步探究坦布苏病毒的跨宿主传播机制及其致病分子机理提供了材料、打下了基础。     

鸡IRF7原核表达及多克隆抗体制备

为了制备鸡干扰素调节因子7(interferon regulatory fator 7,IRF7)抗体,本研究通过分离鸡的外周血淋巴细胞,抽提RNA并反转录获得鸡淋巴细胞c DNA,利用聚合酶链式反应扩增获得鸡IRF7基因(ch IRF7),将该基因克隆入原核表达载体p COLD-TF中,构建成p COLD-TF-ch IRF7原核表达质粒。将测序正确的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经0.25 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导20 h。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得高效表达,大小为107 k Da。切胶免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗鸡IRF7多克隆抗体。激光共聚焦、Western blot实验结果显示,该抗鸡IRF7多克隆抗体能与真核质粒表达的ch IRF7蛋白发生特异性反应。该抗体的成功制备为进一步研究鸡IRF7的表达调控机制奠定了基础。     

马立克氏病病毒编码的vIL8与鸡IL8(cIL8)的抗原相关性初步研究

vIL8是马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)编码的一种病毒源性趋化因子;cIL8(鸡IL8)是鸡重要的抗病毒趋化因子。为研究vIL8与cIL8的相互关系,进而深入探索vIL8在MDV致病中的作用,本研究首先用生物信息学方法对vIL8与cIL8的氨基酸序列进行对比和分析;然后原核表达cIL8,利用SDS电泳分离原核表达的cIL8融合蛋白,并切取目的条带免疫小鼠制备抗cIL8血清,将昆虫细胞表达的vIL8与该抗血清进行免疫荧光反应。结果显示,vIL8与cIL8在结构上均为典型的CXC趋化因子,有类似的受体结合关键氨基酸;荧光试验初步证明,vIL8与cIL8有交叉反应性,两者有共同的抗原表位。结果提示,vIL8与cIL8有相似的抗原性,可能有相同的受体。vIL8的这一特点对于病毒的免疫逃避意义重大。     

抗鹅细小病毒单克隆抗体的制备及其免疫荧光检测方法的建立

为建立免疫荧光检测鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）的方法，本研究利用超速离心纯化的GPV作为免疫原，制备了3株抗GPV特异性单克隆抗体，依次命名为GPV-Mab-6C8、GPV-Mab-1B9、GPV-Mab-2H8。试验结果表明，3株抗GPV抗体特异性良好，并能够中和GPV对鹅胚成纤维细胞的感染能力。利用抗GPV单抗作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测GPV的间接免疫荧光方法（indirect immunofluorescence assay, IFA），该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的GPV，还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的GPV。本研究制备的抗GPV特异性单克隆抗体和建立的检测GPV的免疫荧光方法，为今后GPV细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。     

兽医微生物学课程教学建议

介绍了兽医微生物学课程教学过程中的一些教学建议,包括认真做好绪论和总论课的开头、调动学生的学习兴趣、重视实验教学、搞好教学科研结合等措施,以期为该课程的教学提供参考。     

禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立

为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值.     

鸡T淋巴细胞和B淋巴细胞分离纯化方法的建立

将鸡胸腺和腔上囊淋巴组织剪碎后与PBS磷酸盐缓冲液混合，通过密度梯度离心和尼龙棉柱过滤对T、B淋巴细胞进行了分离纯化。纯化的T、B淋巴细胞以FITC标记的鼠抗鸡CD4单抗，RPE标记的鼠抗鸡CD8单抗，FITC标记的鼠抗鸡Bu-1单抗染色，用流式细胞仪分类检测其纯度，用台盼蓝排斥试验检测T、B淋巴细胞的活力。结果表明，以本研究建立的方法分离到的T、B淋巴细胞纯度较高（均达90％以上），细胞活力强，与流式细胞仪分选的效果相当，且经济简便。