利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin，LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT^-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列，并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段；将供体片段转化至ETEC K88，同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，对LT基因进行敲除；通过PCR验证获得了K88 LT^-缺陷菌株，并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示，λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段，CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除，最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明，K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力丧失，并且生长速度比野生型菌株减缓，LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT^-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

奶牛猝死病例中O101大肠杆菌的分离及部分毒力相关抗原的鉴定

为鉴定引起奶牛猝死综合征的病原及其毒力相关抗原,本研究无菌采集急性死亡奶牛的肝、脾、肾及小肠内容物样本,进行病原菌的分离和纯化,通过微生物学诊断、肠毒素试验、血清学试验、药敏试验和菌毛PCR进行鉴定,结果表明所分离的菌株为产ST肠毒素并具有F41菌毛、血清型为O101的大肠杆菌,该菌株对克林霉素、多黏菌素B、头孢曲松高度敏感。本实验为进行奶牛大肠杆菌性猝死综合征的防治奠定了基础。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b（＋）原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组（P〈0.01）,分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍（P〈0.01）,而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化（P〉0.05）。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。     

断奶仔猪腹泻病因分析

为了解云南省断奶仔猪腹泻的致病性原因,通过对30个发生断奶仔猪腹泻猪场的210份粪便、60份饮用水,总计270份样品,进行病毒及致病性细菌分析。研究结果表明,致病性大肠杆菌严重污染饮用水,致病性大肠杆菌在饮用水中检出40株,阳性率为66.7%,粪便中检出100株,阳性率47.6%;致病性沙门氏菌在饮用水中检出10株,阳性率为16.7%,粪便中检出24株,阳性率为11.4%,均对亚胺培南敏感。在粪便中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirous type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)及猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)的PCR扩增阳性率为5.2%~13.0%,在饮用水中未检出。通过对云南省断奶仔猪腹泻进行病因分析,了解断奶仔猪腹泻的具体原因,本试验结果为从病因入手防制该病提供更合理、更切合实际情况的理论依据与试验参考。     

苏云金芽孢杆菌肠毒素基因entFM的定位与序列分析

摘要：为确定Bt WB9的entFM基因是位于染色体或位于质粒上,以及明确entFM基因的特性,以entFM基因片段制备探针,通过Southern 杂交,分别对染色体DNA和质粒DNA进行杂交定位。结果表明,Bt WB9的entFM基因位于染色体上;克隆了Bt WB9、1072、TS16及Bc6A1 entFM基因ORF序列,序列分析表明,WB9 entFM基因的ORF序列共有个1281个核苷酸组成,可编码426个氨基酸。将WB9、TS16、1072 和Bc6A1 entFM基因编码的氨基酸序列与Bc Cx5相应氨基酸序列进行比较,结果显示WB9、TS16、1072与Bc Cx5之间有很高的相似性,主要差异在于Bc Cx5的EntFM氨基酸序列在39-42位置多出QTQT（谷氨酰胺-苏氨酸-谷氨酰胺-苏氨酸）四个氨基酸,在96-99位置还有SWDK四个氨基酸的差异。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌及其肠毒素等指标在发酵牛肉加工过程中变化规律的研究

作者对自然状态发酵牛肉、接种金黄色葡萄球菌的发酵牛肉和接种发酵剂(植物乳杆菌、戊糖片球菌)与金黄色葡萄球菌的发酵牛肉中金黄色葡萄球菌及其肠毒素等指标在加工过程中的变化规律做了研究。研究结果表明,自然发酵牛肉中没有金黄色葡萄球菌及其肠毒素;接种发酵剂和金黄色葡萄球菌的发酵牛肉中金黄色葡萄球菌先是上升然后快速下降,且金黄色葡萄球菌肠毒素为阴性;接种金黄色葡萄球菌的发酵牛肉中金黄色葡萄球菌及其肠毒素都显著高于接种发酵剂的发酵牛肉(P＜0.05)。由试验结果可知,发酵剂植物乳杆菌和戊糖片球菌对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用。     

空肠弯杆菌研究现状

空肠弯杆菌是一种人兽共同感染的病原菌,也是导致腹泻最常见的病菌,主要症状是发热和急性肠炎。主要从病原的生物学特征、肠毒素的研究、人畜带菌率及流行病学的研究现状进行综合讨论     

白杨素对金黄色葡萄球菌肠毒素SEA和SEB表达的影响

为研究白杨素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性以及该化合物对金黄色葡萄球菌肠毒素SEA和SEB表达的影响,应用肉汤微量稀释法检测了白杨素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,采用TNF-α释放试验、蛋白免疫试验以及荧光定量PCR等方法分别从蛋白表型、蛋白水平和基因水平3个层面上考察了白杨素对金黄色葡萄球菌肠毒素SEA和SEB分泌的影响。结果表明:白杨素几乎无抗金黄色葡萄球菌活性,其MIC1 024μg/m L。低浓度白杨素(2~16μg/m L)即可抑制金黄色葡萄球菌肠毒素SEA和SEB的分泌,且这一抑制作用呈现剂量依赖性。