大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

草酸诱导紫花苜蓿对霜霉病的抗性

为确定外源草酸(OA)对紫花苜蓿(Medicago sativa)抗霜霉病(Peronospora aestivalis)的诱导作用,本研究采用喷雾法将10、20、30、40 mmol·L-1的草酸喷洒在十叶期紫花苜蓿幼苗上,喷雾后7 d测定苜蓿霜霉病苗期病情指数,并分别于喷雾后1、3、5、7和9 d测定叶片过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果表明,喷雾10~40 mmol·L-1草酸溶液均可降低苜蓿霜霉病的病情指数,且随着草酸浓度升高,病情指数由31.1%下降到19.6%,下降了11.5百分点,相对诱导抗病效果呈上升趋势,最高诱抗效果达到50.8%,苜蓿叶片中POD、PAL和SOD的活性增强。     

松材线虫侵染对松树苯丙氨酸解氨酶及酚类物质的影响

以湿地松（Pinus elliottii Engelm）、日本黑松（Pinus thunbergii Parl）为材料,研究松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus（Steiner＆Buhrer,1934）Nickle]感染对苯丙氨酸解氨酶和酚类物质的影响.两种松树的苯丙氨酸解氨酶的活性在发病过程中都有明显增加,并且伴随着酶活性的变化,各种苯丙烷次生代谢产物,如总酚、类黄酮的含量也发生明显的变化.但湿地松在苯丙氨酸解氨酶活力和酚类物质的积累上的变化比黑松要大些.结果表明,松材线虫病的发生、发展与寄主植物苯丙氨酸解氨酶活性和酚类物质含量变化有关.     

银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析

根据其他植物PAL基因的DNA序列的保守区域，设计了一对简并引物，经PCR扩增，得到一条862 bp的特异性扩增带。将PCR扩增产物构建到T-载体并测序，获得了862 bp DNA序列。通过分析所得的862 bp DNA序列及其编码的氨基酸序列，与其他植物PAL基因的DNA序列和蛋白质序列分别进行比较，证实了所得序列为银杏PAL基因的部分序列。Gbpal1已经被Genebank收录，序列号为AY578145。Southern杂交结果表明银杏PAL是一个多基因家族。     

核桃硬壳发育期内果皮木质素与相关酶活性的#br# 变化

 以‘赞美’和‘珍珠香’核桃（Juglans regia L.）果实为试材,采用间苯三酚–HCl 法观察 了内果皮木质化过程,测定了其发育过程中木质素、纤维素和酚类物质含量以及相关酶活性的变化。结 果表明：两个品种核桃硬壳木质化始于6 月初,6 月中旬初步成型,7 月下旬完成。从硬壳木质化至坚果 采收,木质素、纤维素和酚类物质含量均呈逐渐升高趋势,但酚类物质含量在采前略有下降,POD 和PAL 活性均呈下降趋势,PPO 活性整体变化不大。相关分析表明,核桃硬壳分化期木质素含量与纤维素含量 极显著正相关,酚类物质含量与木质素含量极显著正相关,与纤维素含量显著正相关;POD 活性与木质 素、纤维素、酚类物质含量极显著负相关,与PAL 活性极显著正相关。     

不同光质对长鞭红景天悬浮细胞生长及苯丙氨酸解氨酶活性的影响

对不同光质条件下长鞭红景天悬浮细胞生物量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性水平进行检测,探讨长鞭红景天次生代谢和环境调节之间的相关性.结果表明:1)长鞭红景天悬浮培养细胞生物量变化为S型曲线,6～9 d进入直线生长期,PAL活性也表现出一定的规律性,在细胞指数生长期急剧上升,至细胞干质量最大时,活性最大,生长停止期时急速下降至初始水平;2)不同光质在较长时间辐射处理下,长鞭红景天悬浮细胞生物量表现出一定的差异,PAL活性也随之不同,其中长时间的红光处理有利于酶活性的提高,但生物量显著低于白光处理.     

北青龙衣褐变机制的研究

北青龙衣在由鲜品到干品的贮藏期间会出现失水、颜色变深等褐变现象。研究该褐变过程发生的机制,为控制褐变、提高药材的稳定性提供试验依据。采用北青龙衣鲜果果皮,4℃低温贮藏,研究其褐变度(browning degree,BD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性变化、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总多酚(total polyphenols,TP)、还原糖含量及维生素C(Vitamin C,VC)含量变化。试验数据显示果皮颜色变深、TP含量下降、PPO活性降低、PAL活性上升、SOD和POD活性先上升后下降、MDA含量升高、还原糖和VC含量下降。BD与PPO、SOD、POD活性和TP含量呈显著负相关,与PAL活性呈显著正相关,与VC和还原糖无显著相关性。北青龙衣贮藏过程中发生了酶促褐变和非酶褐变,且以酶促褐变为主,PPO在酶促褐变中可能起主要作用。     

氨基酸和壳聚糖对烤烟生理特性及香味品质的影响

本文研究了叶面喷施氨基酸和壳聚糖对烤烟烟叶质体色素含量、酶活性的变异以及对致香物质含量的影响.结果表明:打顶后氨基酸处理烟叶叶绿素、类胡萝卜素、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和脂氧合酶(LOX)活性较高,壳聚糖处理影响不显著;氨基酸处理的烟叶致香物质均比壳聚糖处理和CK高,尤其是对苯丙氨酸类、美拉德反应产物类影响显著,增幅分别达到20.9%、23.1%.壳聚糖对苯丙氨酸类致香物质有较大提高,增幅为17.6%.从整体上看,氨基酸处理调整了发育后期质体色素组分比例和相关酶类的活性,对烟叶香味品质的影响效果要好于壳聚糖.     

龙眼叶片PAL基因的克隆与表达研究

为获得龙眼PAL基因的序列，并研究该基因在转录水平的表达，采用反转录PCR获得PAL的保守序列，然后利用RACE法克隆PAL基因的3'cDNA和5'cDNA序列，再利用DNAMAN软件拼接获得PAL基因的cDNA全长序列。以actin基因作为内参进行实时荧光定量PCR，研究PAL基因在4个龙眼品种嫩叶中的表达差异。结果表明，克隆得到Dlpal基因的cDNA全长序列为2 532 bp，开放阅读框为2 101 bp，编码839个氨基酸，分子量为92.259 ku，等电点为7.38。BLAST比对结果显示，该序列与其它物种的PAL基因具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明，Dlpal基因在4个龙眼品种‘乌龙岭’、‘松风本’、‘立冬本’和‘石峡’的嫩叶间的表达量差异显著，其中在‘立冬本’中表达量最高，在松风本中表达量最低。初步证明PAL基因在不同品种的龙眼叶片中的表达量差异显著。     

大田遮荫对紫心甘薯块根中酶活性的影响

在大田条件下,采用人工遮荫的方法探讨光照不足导致紫心甘薯块根品质下降的酶学机制。研究结果表明:在遮荫条件下,2个甘薯品种济薯18和Ayamurasaki叶片RUBPCase活性显著降低;叶片和块根中ATPase活性下降;块根ADPGPPase和UDPGPPase活性均显著降低,降低幅度随胁迫强度而增加;遮荫对块根可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS)和淀粉粒结合态淀粉合成酶(granulebound starch synthase,GBSS)活性的影响存在品种间差异,济薯18块根SSS活性显著降低,GBSS活性则不同程度高于对照,而Ayamurasaki的SSS活性却高于对照,GBSS活性则随遮光胁迫强度而降低;遮荫对花青素合成的关键酶苯丙氨酸解氨酶(Phenglalanine Ammonia Lyase,PAL)活性影响则很小。因此,遮荫胁迫从源库流各环节影响了紫心甘薯品质合成相关酶,其中RUBPCase、ATPase、ADPGPPase和UDPGPPase活性显著降低是导致紫心甘薯块根品质下降的主要原因。