猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。  

尿嘧啶、三价因子和ATP对牛卵母细胞体外成熟的影响

研究了尿嘧啶、三价因子和三磷酸腺苷二钠盐(ATP)对牛卵母细胞体外成熟及后期发育的影响。结果表明,培养液中添加尿嘧啶和三价因子能够促进颗粒细胞的增殖,提高牛卵母细胞的成熟率、卵裂率及8~16细胞率;ATP对牛卵母细胞成熟率影响不大,但能提高孤雌激活胚胎发育能力。  

影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素

卵母细胞是胚胎工程和发育生物学的重要组成部分，它是体外受精、性别控制、克隆及转基因等技术成功与否的前提和关键。影响猪卵母细胞体外成熟的因素很多，本文将从物理因素和化学因素两方面作简要综述。  

猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻后的体外成熟

本研究旨在探索建立猪GV（Germinal visiele）期卵母细胞的冷冻保存方法。用抽吸法采集屠宰猪卵巢中直径为2—5mm及〉5mm的卵泡卵母细胞，再用切割法采集直径〈2mm的卵泡卵母细胞。结果表明，切割法所获卵母细胞数及每只卵巢平均采卵数均显著高于抽吸法（P〈0．05）；但切割法所获卵母细胞可用率仅为33．8％，显著低于抽吸法67．5％的可用率（P〈0．05）。用抽吸法采集直径为2—5mm的卵泡卵母细胞，进行体外成熟和玻璃化冷冻研究。4组成熟培养结果表明，卵母细胞在添加激素和猪卵泡液（pFF）的成熟培养液中培养24h后转入无激素、无卵泡液的基础培养液中继续培养20h，体外成熟率达78．9％，显著高于另外3组（P〈0．05）。以EFS40作为玻璃化冷冻液，比较细管法和OPS（Open pulled straw）法对猪GV期卵母细胞的冷冻效果，从冻后形态正常率来看，两种方法间无统计学差异（P〉0．05）；但OPS法冷冻猪GV期卵母细胞的冻后存活率和体外成熟率均显著高于细管法（P〈0．05）。  

玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响

猪体外成熟培养的卵母细胞用平皿-微滴法玻璃化冷冻,冷冻解冻后对其超微结构损伤和正常的体外成熟培养的卵母细胞进行了电镜观察比较。结果表明,玻璃化冷冻的卵母细胞解冻后有不同程度的结构损伤,包括:透明带破裂;微绒毛几乎消失;有的部位质膜模糊甚至破裂;质膜下皮质颗粒减少;线粒体膨胀,电子致密度下降,嵴消失;大量囊泡在质膜周围变形融合;细胞基质出现空白区。玻璃化冷冻引起卵母细胞结构损伤是导致卵母细胞解冻后存活力下降和受精率降低的主要原因。  

外源激素和眼柄提取物对罗氏沼虾卵母细胞的离体诱导作用

使用四种类固醇激素，两种保幼激素类似物和眼柄提取物进行罗氏沼虾离体卵巢小块培育，于２５℃培育２４ｈ后切片并进行光谱观察。发现１７α－羟孕酮，孕酮和ＪＨＡ－ＺＲ５１５对卵黄发生前期卵黄发生期卵母细胞卵径增大均有极显著刺激作用。高浓度雌二醇对卵黄发生前期卵母细胞卵径增大也有明显刺激作用；高浓度ＪＨＡ－ＺＲ５１２对成熟前卵巢卵母细胞卵径增大有显著作用，蜕皮激素对卵径增大无作用。眼柄提取物对卵黄发生期卵母  

小鼠卵母细胞第一极体的采集与保存

用孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)对6~8周龄的雌性昆明系及ICR系小鼠进行超数排卵处理,从注射hCG后10 h起每间隔2 h采集小鼠的卵丘卵母细胞复合体(COCs),对卵母细胞的第一极体(PbI)进行数量和形态分级统计,并用台盼蓝染色法鉴定第一极体的活力;同时,对新获取的卵丘卵母细胞复合体进行不同温度保存条件试验。结果表明,在注射hCG后12 h所获得的第一极体活性最高;在室温和37℃下,第一极体的活力在6 h后便完全丧失,而在4℃下保存的第一极体,经过48 h后其活力依然良好。  

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液.结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199 (Ⅰ) 液和TCM-199 (Ⅱ) 液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择.  

山羊不同卵母细胞体外成熟研究

实验对山羊不同分级卵母细胞体外成熟进行了微滴法培养,得出A、B、C三级卵母细胞成熟后,第一极体排出率分别为71 8%;43 3%和10 9%(P<0 01)。结果表明,卵母细胞胞质均一致密,外围至少有3层以上的颗粒细胞包裹,而且包裹致密的卵母细胞能用来生产体外胚胎。  

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下，回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理，同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢，观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精，观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后，未处理组移植体回收率为85.4%，与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段，回收卵母细胞均处在GV期，平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚，2-细胞胚胎发育率为17.5%，未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成，有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体，平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚，其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚，GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%，囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05），2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01），处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用，但不增加卵母细胞产量。