A型流感病毒神经氨酸酶蛋白功能研究进展

A型流感病毒(IAV)的宿主谱广泛,对人类健康和畜禽养殖均构成严重威胁。神经氨酸酶(neuraminidase, NA)作为IAV囊膜表面主要的糖蛋白之一,在病毒的感染过程中至关重要,是常用的抗病毒药物作用靶点。以往关于NA蛋白的研究主要聚焦于其通过切割宿主细胞表面唾液酸与血凝素(hemagglutinin, HA)之间的α-2,6或α-2,3糖苷键以促进新生病毒粒子释放的功能方面,而近来不断有证据表明,神经氨酸酶蛋白在受体结合和宿主适应性方面同样发挥关键作用。论文综述了神经氨酸酶蛋白的结构特征,并对神经氨酸酶蛋白的酶催化活性、受体结合功能以及与HA蛋白的功能平衡方面进行了总结,以期为深入理解IAV感染的分子机制提供参考。     

青蒿素与二甲氧苄啶联合抗鸡球虫的试验研究

为研究青蒿素(ART)与二甲氧苄啶(DVD)联合应用抗鸡球虫的效果,选用75只黄羽肉鸡,分为5个组,除阴性对照组外,ART组、DVD组、ART+DVD组和阳性对照组经嗉囊接种8×10~4个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,各组在攻虫前一天用药直至试验结束,观察鸡群发病和死亡情况,记录相对增重率、存活率、卵囊值、病变记分、血便数,计算抗球虫指数(ACI)。血便数结果显示,ART+DVD组高于DVD组,低于ART组和阳性对照组;存活率、病变记分、平均增重等结果显示,ART+DVD组低于DVD组,高于ART组。结果表明,ART单独使用时具有一定的抗球虫效果,但将其与抗菌增效剂联用则不仅能增强抗球虫效果,更可减少DVD的用药量,从而降低了DVD残留的可能性。     

鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定

选取不同日龄的SPF鸡胚进行骨架染色,确定软骨最佳取材日龄为15日龄,分离关节软骨,采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶两步消化法获取软骨细胞。CCK-8法检测细胞增殖率,阿利新蓝染色及实时荧光定量PCR技术检测软骨细胞标志性基因表达来鉴定分离培养的软骨细胞。结果显示,分离培养的软骨细胞3～5 d时增殖较快,阿利新蓝染色阳性,能够表达sox9、colⅡ、acan、vegfA和mmp13等不同分化阶段标志性基因,且随着体外培养时间的增加,晚期表达基因vegfA和mmp13 mRNA表达上调。结果表明,分离培养的鸡胚软骨细胞具有软骨细胞表型,可作为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究模型。本试验旨在建立鸡胚原代软骨细胞的体外培养体系,以期为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究提供理论依据。     

一株H3N2亚型猪流感病毒株的分离鉴定及对猪的感染性研究

为探究猪流感病毒(SIV)黑龙江分离株的基本特性,本研究将2007年从黑龙江省某猪场采集的鼻拭子样品接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离,经微量血凝试验、HA和NA基因RT-PCR扩增并测序确定其病原特异性,与Gen Bank已登录的序列进行比对分别分析HA和NA基因序列的同源性,进行动物回归试验确定该分离病毒对猪的致病力。结果显示,接种鼻拭子样品的SPF鸡胚尿囊液有凝集鸡红细胞的活性,经RT-PCR扩增出H3和N2目的基因片段,HA基因序列(HM765432)与A/swine/Korea/CAS07/2005(H3N2)(EU798791)的HA基因序列同源性为98%,NA基因序列(HM765434)与A/swine/Korea/CAS09/2006(H3N2)(EU798832)的NA基因序列同源性为98%,结果表明分离株为H3N2亚型SIV。动物回归试验结果显示,该分离病毒能够使80%猪发病,且与临床发病猪的症状类似,表明该分离病毒对猪具有较强的致病力,有望成为H3N2亚型SIV疫苗效力评价用效检病毒株。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

姜黄素对猪脂肪间充质干细胞脂肪合成和分解相关基因mRNA表达的影响

为了探讨姜黄素对猪脂肪间充质干细胞脂肪合成和分解相关基因mRNA表达的影响,从断奶仔猪皮下脂肪分离得到间充质干细胞,增殖培养,诱导分化,并在分化的同时进行姜黄素处理。试验分对照组(诱导分化液+姜黄素溶解试剂DMSO)和处理组(诱导分化液+10μmol/L姜黄素),分化48 h后收集细胞,进行后续检测。结果表明:10μmol/L姜黄素处理能显著降低猪脂肪细胞甘油三酯的含量,而对细胞增殖能力没有明显影响。荧光定量PCR结果显示,脂肪分化过程中的两个重要转录因子过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和CCAAT增强子结合蛋白-β(C/EBP-β),脂肪合成过程中两个关键酶脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达在10μmol/L姜黄素处理组均显著下降,而脂肪分解基因激素敏感脂肪酶(HSL)和脂肪组织三酰甘油水解酶(ATGL)mRNA表达以及酶活在10μmol/L姜黄素处理组均显著升高。结果提示姜黄素降低猪脂肪间充质干细胞脂肪沉积,有可能是通过抑制脂肪合成和增强脂肪分解两个过程来实现的,为姜黄素作为减少猪脂肪沉积的饲料添加剂的应用提供了理论支持。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

猪感染牛病毒性腹泻病毒研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、绵羊边界病毒(Border disease virus,BDV)同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)[1],而且在血清学上具有一定的交叉反应,它们所引起的传染性疾病给各国养牛、养猪和养羊业造成了严重的危害。牛病毒性腹泻病(BVD)呈世界性流行,给各国养殖业造成了严重的经济损失[2]。但直到2012年,世界动物卫生组织(Office International Des     

CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌表达

有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将重组载体转化到枯草芽胞杆菌WB600中,用IPTG诱导重组菌表达,发酵液离心后取上清液,通过SDS-PAGE和Western blot方法分析蛋白表达情况。发酵上清液经Ni-IDA琼脂糖树脂纯化,与流感病毒HA抗原混合后共同滴鼻免疫小鼠后采集小鼠血清和支气管肺泡灌洗液检测IgG和IgA的抗体水平。结果显示：重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中能够分泌表达,在发酵罐中发酵36 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小在42 kDa左右,蛋白产量最高能到700μg/mL,Western blot检测目的蛋白正确表达。重组蛋白经过Ni-IDA琼脂亲和层析纯化后与HA抗原混和滴鼻免疫小鼠,ELISA结果显示CTA1-DD蛋白组针对HA抗原能够诱导更高的血清IgG和黏膜IgA抗体水平,说明枯草芽胞杆菌表达的CTA1-DD蛋白具有佐剂活性...