人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

优化的小鼠STO细胞系重编程多功能干细胞的建立

研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系.     

白菜NAC转录因子BrcCUC3基因克隆及其对叶缘和主枝发育的影响

植物NAC (矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因)转录因子CUP-SHAPED COTYLEDON(CUC)亚家族成员在植物茎尖分生组织形态建成、器官边界分离、叶发育方面发挥着重要作用.采用基因同源克隆的方法获得了白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)基因BrcCUC3,并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)做了初步的功能鉴定.研究结果表明,白菜Brc CUC3的编码区长1 008 bp,编码335个氨基酸,基因结构分析显示BrcCUC3包含3个外显子、2个内含子,内含子剪接位点符合GT-AG规则.氨基酸序列分析表明,BrcCUC3蛋白具有典型的植物NAC domain结构域.BrcCUC3编码区氨基酸序列与其它植物的CUC3蛋白有很高的一致性,尤其与甘蓝(Brasica oleracea)、萝卜(Raphanus sativus)和拟南芥CUC3蛋白高度一致,一致性分别达到98％,97％和83％.在不同物种CUC3的系统进化树上,BrcCUC3归属于双子叶植物分支的十字花科亚组,由不同植物20条CUC3编码区氨基酸序列所建立的系统进化树与真实的植物进化基本一致.荧光定量PCR分析结果表明,BrcCUC3在白菜叶深裂株系叶片中的表达量比叶全缘叶片中的高.利用根癌农杆菌(A grobacterium tumefaciens)浸花法转化拟南芥,获得了转BrcCUC3基因的拟南芥植株.过表达BrcCUC3的转基因拟南芥呈现叶缘出现裂刻、主枝增加的新表型.初步说明该基因参与叶形和主枝的发育调控,为揭示白菜叶形发育分子调控机制和通过基因工程创制植物叶形新种质提供分子依据.     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

抗速灭威单链抗体基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质研究

选用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）系统表达特异性抗速灭威单链抗体（scFv）基因,以为速灭威特异性抗体的大量制备奠定基础。设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,获得重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris（X-33）,对转化子进行抗性梯度筛选得到一株高效表达的X-33-Pp-SMW-12-6菌株。对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果表明：P.pastoris-scFv的质量接近其亲本E.coli-scFv的质量,X-33-Pp-SMW12-6在优化条件下的表达产量达28mg/L,比未优化前的产量提高了约8mg/L,经纯化后抗体纯度可达85%以上。因此,利用P.pastoris表达系统制备抗速灭威单链抗体比细菌表达系统更有效、更经济。     

甜瓜化感自毒作用响应基因的cDNA-AFLP分析

本研究以甜瓜种质"新银辉"为试验材料,利用浓度为0.03 g.mL 1的新鲜甜瓜植株水浸提液处理甜瓜幼苗,通过cDNA-AFLP技术分析甜瓜化感自毒作用相关基因及其表达情况。试验中利用82对引物进行扩增,共获得3 600多条差异表达转录衍生片段(TDFs),平均每个引物组合可扩增出30~50条条带,片段大小集中在50~800 bp之间,根据条带强弱和有无的变化,其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表达4种情况。选取其中103条TDFs进行回收、测序,共获得75条有效序列,其中上调表达39条,下调表达21条,瞬时表达15条。BLAST结果分析显示其中55条与已知功能基因具有较高的同源性,选取其中10条TDFs,以甜瓜Actin基因为内参照,对其在不同胁迫处理时间的表达情况进行半定量RT-PCR验证,分析结果与cDNA-AFLP结果基本吻合,表明cDNA-AFLP技术是研究甜瓜化感自毒作用相关基因差异表达的有效方法。55条TDFs的BLAST结果显示,甜瓜自毒作用涉及到的基因表达情况较为复杂,与信号转导、能量代谢、蛋白合成、离子运输、逆境响应和转录调控等过程均有关系,这一结果为探讨甜瓜化感自毒作用的分子机理和相关基因的克隆提供了理论依据。     

论诱导昆虫滞育的环境因素

昆虫滞育是在长期进化过程中昆虫对不利生活环境条件的不断适应以及环境对昆虫的选择造成的。文章论述了温度、光周期、湿度以及食料等主要环境因素对昆虫滞育诱导的影响,认为光周期和温度是诱导昆虫滞育最主要的因素;湿度主要通过改变昆虫对光周期和温度的刺激反应而影响滞育的诱导;食料作为昆虫的调节因子与光周期以及温度一起诱导昆虫的滞育,在温度和光周期都很少发生年变化的赤道地区,食料能够直接影响到昆虫的生长发育。     

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppression subtracfive hybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM—TEasy Vecter连接,转化E．coli DH5α,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。