调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子，探究该基因的表达调控机制，本研究以民猪基因组DNA为模板，通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段，与pMD18-T载体连接构建克隆质粒；通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒；将重组质粒转染PK15细胞系，利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性；根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域；利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点，根据预测结果，使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体，在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明，试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段，其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现，-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域，经生物信息学分析发现，该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体，经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失，会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

Development,and genetic and metabolic characterization of new tomato mutants with enhanced and deficient carotenoid content

Tomato (Solanum lycopersicum) is a valuable vegetable crop rich in health-protective carotenoids, but breeding improvements are limited by its narrow genetic diversity. New mutants with enhanced and deficient carotenoid content in a single genetic background of tomato cv. MicroTom were developed via chemical mutagenesis. Genetic and metabolic analyses showed that mutant DC260, which exhibited fruit color alteration from red to deep red interlaced with orange color, had significant (P < 0.05) increases of lycopene (up to 42.8%) and ß-carotene (up to 61.5%) compared with control plants. Pearson correlation analysis of M1 and M2 generations in DC260 revealed that fruit color alteration was significantly (P < 0.05) correlated with lycopene (coefficient = 0.55) and ß-carotene content (coefficient = 0.63). The fruit color alteration of DC260 was controlled by a single gene at a heterozygous locus. In contrast, mutant DC107 and DC624, which exhibited fruit color alteration from red to orange-yellow, was significantly (P < 0.05) carotenoid-deficient with up to 346.3-, 10.8-, and 185.2- fold reductions of lycopene, ß-carotene, and total carotenoids, respectively, compared with the control plants. Carotenoid deficiency in DC170 and DC624 was responsible for the fruit color alteration and was controlled by a dominant gene at a homozygous locus.     

金黄色葡萄球菌细胞壁变化与β-内酰胺类抗生素耐药的关系

旨在揭示金黄色葡萄球菌针对β-内酰胺类抗生素可能存在细胞壁增厚的耐药机制。2016-2018年间，采集宁夏地区部分奶牛养殖场临床及亚临床型乳腺炎的乳样，通过显色培养基鉴别、镜检及PCR方法，分离鉴定牛乳源金黄色葡萄球菌；利用微量肉汤稀释法测定细菌对14种抗菌药物的耐药性，了解本地区金黄色葡萄球菌的耐药率及多重耐药情况；通过qRT-PCR方法检测细胞壁增厚相关的pbpB、murG、glmU、atlR基因转录丰度，并结合透射电镜进行形态观察，以确定增厚及发生原因。结果显示，分离鉴定出261株牛乳源金黄色葡萄球菌，其中包括9株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。药敏试验结果显示，金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素具有较高的耐药率，其中氨苄西林为79.69%，青霉素为78.54%。多重耐药情况是以3、7和8重耐药的菌株居多；其中1株耐药种数达14种之多。qRT-PCR结果表明，4种相关基因的转录丰度均极显著上调（P<0.001或P<0.01）。透射电镜观察发现，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）JY21菌株的细胞壁在64和128 μg·mL^-1的青霉素浓度下，较对照组均极显著增厚（P<0.001），并可见细胞壁表面粗糙，有结节状凸起；但药物浓度从64 μg·mL^-1升高至128 μg·mL^-1细胞壁不再显著增厚（P>0.05）。MRSA WLD10菌株细胞壁未出现明显增厚（P>0.05）。综上所述，本地区牛乳源金黄色葡萄球菌针对β-内酰胺类抗生素，存在细胞壁增厚的耐药机制；增厚的原因主要是肽聚糖的过度合成及细胞自溶的减少。与MSSA JY21菌株相比，细胞壁增厚并非MRSA WLD10重要的耐药机制。     

宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的分析及作用方式的研究

旨在深入了解宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)所产生β-内酰胺酶的进化及结构特征并揭示其作用方式。分别以药敏试验和PCR方法检测5种β-内酰胺类药物耐药情况和耐药基因;通过生物信息学手段对检出的β-内酰胺酶BlaZ作进化分析及结构功能预测;利用分子对接和动力学模拟,分析BlaZ的作用方式。结果表明,青霉素类药物的耐药率明显高于头孢菌素;blaZ基因检出率为82.37%,并检出SA中较少报道的blaZTEM-1基因,检出率为26.05%;进化分析可知,BlaZ属于A型β-内酰胺酶,包含63个重要且承受进化压力的踪迹残基;分子对接发现,BlaZ易与青霉素类药物及阿维巴坦等抑制剂结合并形成稳定复合物;动力学模拟显示,BlaZ的结构柔性小于同型酶TEM-1和TEM-52,其中Ω-loop区域柔性存在差异(P<0.05)且能影响与药物的作用,即该区域柔性与结合活性呈正相关;BlaZ分别与氨苄西林和头孢噻呋结合时结构稳定性差异显著(P<0.05)。宁夏地区牛源SA产生的β-内酰胺酶BlaZ属A型,并从菌株中检出blaZTEM-1基因;BlaZ对青霉素类药物的结合活性高于头孢菌素且易于结合阿维巴坦等抑制剂,其中Ω-loop区域的结构柔性是BlaZ与药物结合活性的重要影响因素。     

衣藻β–胡萝卜素加酮酶基因在南瓜果实中的瞬时表达

为了研究β–胡萝卜素加酮酶基因在南瓜中合成酮基类胡萝卜素的功能,采用农杆菌介导瞬时表达技术,将含有衣藻β–胡萝卜素加酮酶基因CrBKT的pBI121-CMTPCRBKT载体和pBI121对照载体的农杆菌菌液注入授粉后2、5、10、15和25 d的南瓜果实中,3 d后观察发现,授粉后2和5 d的果实转化后果肉呈微红,其中授粉后5 d的颜色较深,而10 d以上的无红色色素积累。经高效液相色谱(HPLC)分析色素成分,发现积累的红色色素为酮基类胡萝卜素角黄素和虾青素。与对照相比,注入CrBKT基因的授粉后2和5 d的幼果中的类胡萝卜素含量显著增加,5 d的幼果约增加了1/3,且含有106.31μg·g~(-1)酮类胡萝卜素,其中角黄素占80.65%,虾青素占19.35%,而授粉后10 d以上的果实类胡萝卜素含量没有明显变化,也没有酮类胡萝卜素的积累。PCR扩增表明转化组织中表达了该基因。结果表明,CrBKT基因只能在授粉后5 d以内的幼果中表达,并将幼果中的类胡萝卜素转化为酮基类胡萝卜素;随着果实成熟,菌液在果肉组织中无法渗透而阻碍基因表达。     

β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。     

苯乙醇胺A及其残留检测方法研究进展

苯乙醇胺A作为一种新型的β-兴奋剂,具有促进动物蛋白质合成、提高饲料转化率的作用,但其在动物性食品中的残留物对人体健康构成威胁,故近年来引起各界学者的广泛关注。因此建立便捷高效的检测方法至关重要。主要介绍了苯乙醇胺A的理化性质、药理作用、代谢规律、毒理研究以及其在不同样品基质中残留检测的方法,对研究方法的开发与研究提供有益帮助。     

马兜铃酸A致大鼠肾病的肾毒性作用机理研究

以大鼠为靶动物进行亚慢性毒性试验,探究马兜铃酸A的肾毒性作用机理。将56只健康雄性Wistar大鼠适应性饲养1周,随机分为马兜铃酸A高剂量组(40 mg/kg BW)、马兜铃酸A中剂量组(8 mg/kg BW)、马兜铃酸A低剂量组(4 mg/kg BW)和空白组4组,试验持续28 d,后进行14 d恢复性试验。通过监测体质量,计算肾脏指数,检测血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)和肌酐(SCr)的含量,检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC),观察肾脏的组织病理学变化,采用实时荧光定量PCR检测相关基因mRNA的表达情况,来综合评价马兜铃酸A的肾毒性作用。结果分析显示,从第16天开始马兜铃酸A高剂量组大鼠体质量显著低于空白组(P<0.05);肾脏指数各组间差异不显著;试验第28天,高剂量组BUN、UA、CA含量均显著高于空白组(P<0.05),中剂量组BUN、UA含量均显著高于空白组(P<0.05),低剂量组UA含量显著高于空白组(P<0.05),试验第42天,高剂量组的BUN、UA、CA含量仍然均显著高于空白组(P<0.05),中剂量组CA含量显著高于空白组(P<0.05);试验第28天,高剂量组MDA含量显著高于空白组(P<0.05),SOD、GSH-Px活性均显著低于空白组(P<0.05),中剂量组和低剂量组GSH-Px活性显著低于空白组(P<0.05),试验第42天,高剂量组MDA含量仍然显著高于空白组(P<0.05),SOD、GSH-Px活性和T-AOC均显著低于空白组(P<0.05),中剂量组SOD、GSH-Px活性和T-AOC均显著低于空白组(P<0.05),低剂量组MDA含量显著高于空白组(P<0.05),GSH-Px活性显著低于空白组(P<0.05);肾脏组织病理学观察发与组织和细胞层面的损伤程度大体呈剂量相关性;试验第28天和第42天,高剂量组和中剂量组TGF-β1、smad3、collagen1、collagen3的mRNA表达量显著高于空白组(P<0.05),低剂量组TGF-β1、smad3的mRNA表达量显著高于空白组(P<0.05)。说明马兜铃酸A对大鼠肾脏有毒性作用,肾功能被损害,引起一定程度的肾纤维化,这种损害作用在一定时间内不能自行恢复。马兜铃酸A的毒性作用可能与氧化应激与TGF-β1/smad通路作用有关。     

Utility of progesterone receptor-ires-Cre to generate conditional knockout mice for uterine study

In mice, the conditional knockout strategy using the Cre-loxP system is useful for various types of research. The Cre mouse line with progesterone receptor promoter (Pgr^Cre) has been widely used to produce specific uterine gene-deficient mice, but in the Cre line, endogenous Pgr gene is replaced by Cre recombinase gene, which makes the breeding of homozygous mice (Pgr^Cre/Cre) difficult because they are infertile. Yang et al. (2013, https://10.1016/j.cell.2013.04.017 ) reported the generation of another Pgr^iresCre mouse line that still has endogenous Pgr gene, and they inserted Cre recombinase downstream of the Pgr gene via an internal ribosome entry site (IRES). It is possible that this new Pgr^iresCre line would be useful for uterine research as the mice can be bred as homozygotes (Pgr^{iresCre/iresCre}). Herein, we confirmed the Pgr^iresCre mice effectively directed recombination in the female reproductive tract and was capable of genetic alteration in the endometrium that enables the studies of its uterine function. Our findings demonstrate that the new Pgr^iresCre mouse line is also useful for the generation of uterine-specific knockout mice. The findings using Pgr^iresCre mouse will contribute to the understanding of reproductive systems and diseases in humans and domestic animals.