斑鳜胃蛋白酶原C及其5'侧翼区的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR和RACE等技术克隆了斑鳜(Siniperca scherzeri)胃蛋白酶原C(pepsinogen C,PGC)的cDNA全长和部分DNA序列,结果表明:PGC cDNA序列全长1 505 bp,5'端非翻译区37 bp,3'端非翻译区304 bp,开放阅读框架(ORF)1 164 bp,共编码含有387个氨基酸的蛋白质,包括由16个氨基酸组成的信号肽、39个氨基酸的激活肽和332个氨基酸的成熟肽.斑鳜PGC氨基酸序列与斜带石斑鱼、伯氏豚虾虎鱼、狼鲈、美洲红点鲑4种鱼的相似度分别为92.0%、91.5%、90.2%、89.1%,与非洲爪蟾、鸡、人、兔、褐家鼠的序列相似度分别为76.8%、72.8%、72.5%、69.9%、67.3%,表明PGC基因在长期的进化中较为保守.PGC基因由9个外显子和8个内含子组成,内含子剪切位点符合GT-AG规则,在第7含子中发现(GACA)6、(CA)6类型的微卫星序列,第8内含子中发现(TG)5类型的微卫星序列.采用锚定PCR方法获得了PGC 5'侧翼区长1 924 bp的序列,启动子区域位于-40～+10 bp,包含TATA盒以及GATA-1、CdxA、Hand1/E47、AP-1、Nkx-2、S8、FOX J2等转录因子的结合位点.结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础.     

性成熟前期尼罗罗非鱼雌雄性别生长差异与性类固醇激素水平比较

利用分子标记法、醋酸洋红压片法、组织切片技术等方法进行个体性别鉴定,比较了性成熟前期(0.5~4.0月龄)尼罗罗非鱼雌、雄鱼生长差异,并检测了2.5~4.0月龄雌、雄鱼血清睾酮(T)、雌二醇(E₂)激素含量。结果发现,雌、雄鱼全长、体质量分别自3.0月龄、2.5月龄开始出现差异显著(P<0.05)。Logistic拟合全长、体质量生长方程为:L_t(♀)=16.443/(1+e^{(2.821-1.363*t)}),L_t(♂)=18.248/(1+e^{(2.752-1.295*t)});W_t(♀)=107.704/(1+e^{(5.157-1.464*t)}),W_t(♂)=134.796/(1+e^{(5.080-1.417*t)}),雌、雄鱼体质量生长拐点分别为3.523、3.585月龄,拐点体质量分别为52.352、67.398 g。雄鱼全长、体质量生长速度始终大于雌鱼,雄鱼快速增长期区间长度、体质量增加量大于雌鱼。2.5月龄之后,雌、雄鱼E₂含量差异显著(P<0.05),3.0月龄之后,雌、雄鱼T含量差异显著(P<0.05),推测E₂、T含量差异是引起尼罗罗非鱼雌雄性别生长差异的原因之一。     

不同盐、碱度下3品系尼罗罗非鱼幼鱼网箱养殖的生长比较

以慢性驯化后的上海、山东、河北品系尼岁岁非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼为试验材料,比较它们在盐度组（0、15和20）、碳酸氢钠（NaHCO3）碱度组（1 g·L^-1、2 g·L^-1和3 g·L^-1）以及盐碱混合组（15,1 g·L^-1;15,2 g·L^-1;15,3 g·L^-1;20,1 g·L^-1;20,2 g·L^-1和20,3 g·L^-1）条件下网箱养殖成活率和日均增重率差异.62d试验结果表明,上海、山东、河北品系尼罗罗非鱼幼鱼在不同盐度、碱度、盐碱混合处理组中的成活率差异不显著（P＞0.05）,而日均增重率的差异显著（P＜0.05）.随着盐度、碱度增加,尼罗罗非鱼生长速度大体呈下降趋势;盐碱混合组生长速度较单盐、单碱组减慢.还发现不同品系尼罗罗非鱼在不同盐碱梯度下表现出不同的相对生长优势.研究结果为尼罗罗非鱼适宜养殖的盐碱范围确定、品系筛选提供了重要的基础资料.     

尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂杂交后代的遗传分离分析

应用微卫星标记对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)♀×萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)♂杂交后代(F1、F2)的遗传分离情况进行了初步研究.在86对微卫星引物中,筛选出21对在尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼中存在差异等位基因的特异性引物,共检测出59个等位基因,包含32个尼罗罗非鱼和24个萨罗罗非鱼特异等位基因.F1观测杂合度(Ho=0.998)大于 F2(Ho=0.739), F2有效等位基因数(Ne=2.48)、平均多态信息含量(PIC=0.497)与 F1的(Ne=2.45、PIC=0.489)相似.F1中所有位点均表现为尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼杂合基因型.F2中位点等位基因分离情况各异,通过卡方检验,有18个位点符合孟德尔遗传(P>0.05),2个位点GM145、UNH003表现为偏离孟德尔遗传(P<0.05),1个位点GM276不分离.在18个孟德尔遗传位点中, F2中尼罗罗非鱼特异等位基因频率为48.3%,萨罗罗非鱼特异等位基因频率为47.7%;基因型出现F1型、尼罗罗非鱼型、萨罗罗非鱼型的比例分别为58.2%、19.9%、21.9%.结果表明, F2较好地继承了F1的遗传杂合性,但也存在一定程度的分离.     

鳜三种生长抑素cDNA全长克隆、组织表达及其在脑中定位分析

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜脑中3种生长抑素前体(preprosomatostatin,PSSⅠ、PSSⅡ和PSSⅢ)cDNA全长序列。结果显示,鳜PSSⅠcDNA全长647 bp,含开放阅读框369 bp,共编码122个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽,C端SS-14在脊椎动物中非常保守;PSSⅡcDNA全长655 bp,开放阅读框387 bp,编码128个氨基酸,前25个氨基酸为信号肽,C端带有[Tyr7,Gly10]SS-14;PSSⅢcDNA全长823 bp,开放阅读框333 bp,共编码110个氨基酸,前21个氨基酸为信号肽,C端带有[Pro2]SS-14。利用RT-PCR检测了鳜PSS mRNA的组织表达特征,3种PSS mRNA均在脑中表达,PSSⅠmRNA在其他组织中未检测到表达,PSSⅡmRNA在食道和胃中大量表达,PSSⅢmRNA在肾和性腺中大量表达。推测3种PSS除一致参与神经调控外,PSSⅡ还可参与消化作用调控,PSSⅢ参与调控生殖作用。脑组织原位杂交分析表明,PSSⅠmRNA在下丘脑和延脑中表达,PSSⅡmRNA在下丘脑中表达,PSSⅢmRNA在下丘脑、视觉盖、延脑和脊髓中表达。3种PSS均在下丘脑中表达,表明它们可能参与腺垂体激素分泌的调节;在其他脑区存在表达差异,推测它们还可作为神经递质或调节因子,发挥不同的生物学效应。     

鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA全长的克隆与表达特征

为探明鱼类消化液分泌的相关调控因子,采用RACE技术分别克隆了鳜(Siniperca chuatsi)两种肠道激素——胃泌素(gastrin,GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)基因的cDNA序列。鳜GAS基因cDNA全长581 bp,5′非翻译区长100 bp,3′非翻译区长145 bp,开放阅读框长336 bp,编码111个氨基酸;鳜CCK具有2种类型:CCK1与CCK2,CCK1 cDNA全长为843 bp,5′非翻译区长60 bp,3′非翻译区长369 bp,开放阅读框414 bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846 bp,5′非翻译区长112 bp,3′非翻译区长332 bp,开放阅读框403 bp,编码134个氨基酸。鳜GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明,鳜GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明GAS与CCK同为消化调控因子,而CCK还是神经分泌因子。鳜GAS与CCK mRNA表达贯穿于整个幼体早期发育阶段(孵化后0～22 d),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。     

鳜(♀)×斑鳜(♂)杂种F_1的形态特征与微卫星分析

2006-2008年,在浙江湖州开展了鳜(Siniperca chautsi)与斑鳜(Siniperca scherzeri)的种间杂交试验,并成功获得了鳜(♀)×斑鳜(♂)杂种F1。通过对杂种F1与其亲本的形态差异比较和微卫星标记分析,探讨了杂种F1的性状变异和遗传特征。结果表明:(1)7个可数性状中,杂种F1的背鳍条、腹鳍条和胸鳍条数与父母本一致,臀鳍条、鳃耙数与母本基本一致,侧线鳞、幽门盲囊数目介于父、母本之间;10个可量性状的平均杂种指数为39.08,显示杂种F1的可量性状略偏向母本;框架参数和可量性状的聚类分析、判别分析和主成份分析表明,杂种F1的体型介于父、母本之间,略倾向于母本,主要表现在躯干部和尾部的差异。(2)5对微卫星引物分析表明,杂种F1的等位基因均来源于双亲,杂交子代的遗传符合孟德尔遗传规律,属两性融合生殖,是真正意义上的杂交种。     

鳜(♀)×斑鳜(♂)杂种F_1的形态特征与微卫星分析

2006-2008年,在浙江湖州开展了鳜(Siniperca chautsi)与斑鳜(Siniperca scherzeri)的种间杂交试验,并成功获得了鳜(♀)×斑鳜(♂)杂种F1。通过对杂种F1与其亲本的形态差异比较和微卫星标记分析,探讨了杂种F1的性状变异和遗传特征。结果表明:(1)7个可数性状中,杂种F1的背鳍条、腹鳍条和胸鳍条数与父母本一致,臀鳍条、鳃耙数与母本基本一致,侧线鳞、幽门盲囊数目介于父、母本之间;10个可量性状的平均杂种指数为39.08,显示杂种F1的可量性状略偏向母本;框架参数和可量性状的聚类分析、判别分析和主成份分析表明,杂种F1的体型介于父、母本之间,略倾向于母本,主要表现在躯干部和尾部的差异。(2)5对微卫星引物分析表明,杂种F1的等位基因均来源于双亲,杂交子代的遗传符合孟德尔遗传规律,属两性融合生殖,是真正意义上的杂交种。     

池塘溶氧昼夜变化对鳜葡萄糖代谢和血糖含量的影响

为探究池塘溶氧昼夜变化对鳜(Siniperca chuatsi)葡萄糖代谢和血糖含量的影响,本研究分别在17:00 (T1)、23:00 (T2)、次日07:00 (T3)、11:00 (T4)、17:00 (T5)共5个连续时间点采样并测定分析,比较了鳜池塘常氧组(>5 mg/L)与昼夜溶氧变化组葡萄糖代谢相关指标的时序差异。结果显示,1 d中,池塘溶氧经历常氧与低氧的周期性变化,T3时,池塘溶氧最低,平均为0.93 mg/L;T5时,池塘溶氧最高,平均为10.58 mg/L。T3和T4时,血浆中葡萄糖显著降低,乳酸含量显著升高;肝脏中肝糖原含量下降,乳酸含量显著升高,ATP含量显著降低;肝脏有氧代谢柠檬酸合酶(CS)活性显著降低,无氧代谢酶乳酸脱氢酶(LDH)活性显著升高;糖酵解酶中己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)活性显著升高,糖原分解酶糖原磷酸化酶(GP)活性无显著变化;hk、pfk、pk、ldh-a和gp基因表达量显著上升,cs表达量显著下降,葡萄糖转运蛋白glut2表达量无显著变化。研究表明,鳜养殖池塘中,溶氧存在昼夜周期性交替变化,溶氧水平的下降会引起鳜葡萄糖代谢发生变化,由有氧代谢转变为无氧代谢而导致能量利用方式发生变化。     

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶 A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H⁺/K⁺-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。