碱性蛋白酶水解猪血细胞最优反应条件的研究

研究旨在确立碱性蛋白酶水解猪血细胞的最优反应条件。采用二次旋转正交回归设计,建立了ｐＨ值、温度（Ｔ）、酶—底物浓度比（〔Ｅ〕／〔Ｓ〕）三个因素对水解蛋白收率影响的回归模型。通过分析,确定最优水解条件为：ｐＨ＝８２１,〔Ｅ〕／〔Ｓ〕＝４％,最后,在此最优水解条件下,确定出最佳水解时间ｔ＝９０ｍｉｎ。     

黑褐新糠虾血细胞形态及其与日本新糠虾对溶藻弧菌敏感性的比较

实验采用Giemsa与Wright' s两种染色方法对黑褐新糠虾血细胞进行染色,根据血细胞大小,所含颗粒与否,颗粒多少和核质比将其分型,并对各型血细胞所占比例进行统计.结果表明,通过比较Giemsa染色与Wright's染色两种方法的染色时间和效果,Wright's染色更加适合糠虾血细胞.通过染色,将黑褐新糠虾血细胞分为3种类型,它们分别为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞.它们的胞体大小依次增大,核质比依次降低.对此3种类型血细胞比例分别统计后发现,颗粒细胞所占比例最多约( 48.38％±0.05％),其次是半颗粒细胞约为(35.22％±0.04％),最少的为透明细胞约为(16.40％±0.01％).对不同浓度溶藻弧菌的感染试验发现,日本新糠虾在较短的时间内出现死亡,即48h,而黑褐新糠虾72 h出现死亡,各浓度组中日本新糠虾死亡率均高于黑褐新糠虾.黑褐新糠虾相对日本新糠虾来说,对溶藻弧菌具有较低的敏感性,可能与其血细胞中颗粒和半颗粒比例较高有关.     

日本黄姑鱼血细胞发生的观察

用Wright’sGiemsa混合染料对日本黄姑鱼外周血涂片以及头肾、肾脏、肝脏和脾脏组织印片染色,观察其中各种血细胞的大小、形态特征,研究了日本黄姑鱼血细胞的发生发育模式。观察发现,在外周血涂片中,除红细胞外,还观察到多种白细胞,主要有单核细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞,而嗜碱性细胞没有被发现。红细胞、淋巴细胞和单核细胞的发生主要在肾脏和头肾,其次是脾脏;粒细胞的发生主要在头肾和脾脏。红细胞的发育经历3个阶段:原红细胞、幼红细胞和成熟红细胞阶段。红细胞在成熟过程中,细胞核的体积逐渐变小,细胞与细胞核的体积比由大变小然后再变大。成熟红细胞除了由幼稚细胞发育而来以外,还可以进行一分为二的方式进行分裂;粒细胞的发育经历5个阶段:原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞和成熟粒细胞;淋巴细胞经历了3个阶段:原淋巴细胞、幼淋巴细胞和成熟淋巴细胞;单核细胞的发育和淋巴细胞相似,也经历了3个阶段:原单核细胞、幼单核细胞和成熟单核细胞。     

厚颌鲂外周血细胞形态及细胞化学特征研究

采用血细胞常规染色和细胞化学染色对厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)外周血细胞形态及细胞化学特征进行观察。结果显示:厚颌鲂外周血细胞可分为红细胞、血栓细胞、单核细胞、淋巴细胞和三种类型粒细胞。红细胞有幼稚、成熟和衰老三种形态,其中幼稚和衰老红细胞较少见;血栓细胞数量最多,其次是淋巴细胞。粒细胞中Ⅰ型和Ⅱ型较常见,Ⅲ型粒细胞少有。细胞化学染色显示幼红细胞、血栓细胞和淋巴细胞均呈ACP弱阳性;单核细胞呈ACP和ANAE阳性;Ⅰ型粒细胞是嗜中性粒细胞,POX、ACP和ANAE阳性;Ⅱ型粒细胞是PAS-GL,PAS强阳性和ACP阳性;Ⅲ型粒细胞是Ⅰ型粒细胞的晚期形态。厚颌鲂的PAS-GL可能是嗜酸性/嗜碱性粒细胞,而不是嗜碱性粒细胞的前体。     

驼背鲈血细胞的超微结构

利用电镜技术对驼背鲈（Cromileptes altivelis）外周血细胞的超微结构进行了研究。结果表明,电镜下可区分6种类型的细胞：红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血栓细胞和浆细胞。红细胞呈圆形或椭圆形,可见线粒体、少数囊泡;根据细胞中的颗粒形态大小和细胞核的形态,可将粒细胞分为4种类型：I型粒细胞、II型粒细胞、III型粒细胞和IV型粒细胞。单核细胞圆形,表面较平整,偶有伪足伸出,空泡多见;淋巴细胞的胞质少,仅在细胞核边缘处形成薄薄的一层,细胞器少;血栓细胞异染色质丰富,沿核膜呈带状分布,胞质中有较多大小不等的空泡和少量的线粒体;浆细胞中粗面内质网成层分布包绕在核周围。此外可见到嗜曙红细胞吞噬红细胞、血栓细胞成群聚集分布的现象。     

图像流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分群及吞噬功能研究中的应用

为了更精确地对甲壳动物血细胞进行快速分类和功能分析,本研究以中华绒螯蟹为例,依据其血细胞内具有颗粒结构的特征,与常规显微观察对比,探讨了一种基于图像流式细胞仪的血细胞自动化分类新方法,并测量了体质量为(10±3) g的中华绒螯蟹的血细胞对直径1μm微球的吞噬情况。结果显示,两种方法都可将中华绒螯蟹血细胞分为4个类群。显微镜观察分类基于胞内可见颗粒,但由于缺乏精细的量化标准,批次样品的人工辨识结果波动较大;而图像流式方法以胞内全部颗粒结构为对象,利用高精度检测模块测量,结果更准确、客观,而且通量高、重复性好。测量结果显示,中华绒螯蟹血淋巴中无颗粒、小颗粒、中颗粒及大颗粒细胞占比分别为40.62%±2.65%、36.68%±6.84%、7.80%±1.16%和16.51%±5.60%,依据测量的颗粒特征区分的4个类群界限清晰,缺乏过渡样点,提示各类细胞之间可能没有相互转化。进一步的活体微球吞噬实验证实,中华绒螯蟹的4类血细胞都具有吞噬功能,并以无颗粒细胞为主要吞噬类群;吞噬微球的细胞比例在注射后6 h内呈钟型曲线变化,4 h可达峰值(5.69%±0.44%),表明中华绒螯蟹血细胞能高效清除血淋巴中的异物。研究表明,图像流式细胞仪适合于中华绒螯蟹的血细胞分类分析和功能研究,本研究结果为同类研究提供了重要参考,将有助于更全面了解甲壳动物血细胞的功能。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

脂多糖、多巴胺与蛋白激酶抑制剂联合作用对凡纳滨对虾血细胞吞噬率、胞吐酚氧化酶活力的影响

研究了脂多糖(LPS)、多巴胺(DA)对凡纳滨对虾血细胞吞噬、胞吐及信号通路的影响。结果表明,LPS、DA对凡纳滨对虾血细胞数量、吞噬率和胞吐酚氧化酶活力影响显著(P<0.05),LPS、DA与血细胞孵育30min后,高浓度(1～10mg/L或μmol/L)处理组对虾血细胞数量均随作用浓度增大而明显下降,胞吐酚氧化酶活力则显著升高,LPS处理组对虾血细胞吞噬率显著升高,而DA处理组对虾血细胞吞噬率则表现出明显的下降趋势。同时在LPS作用下,分别加入蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂chelerythrine、genistein后,凡纳滨对虾血细胞吞噬和胞吐作用均受到明显的抑制作用,抑制剂对吞噬的抑制效果为genistein>chelerythrine,对胞吐的抑制效果则为chelerythrine>genistein;在DA作用下,加入蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89后,血细胞吞噬作用得到增强,但对胞吐作用无明显影响,chelerythrine、genistein均抑制对虾血细胞的胞吐作用,抑制剂的作用效果为chelerythrine>genistein,两种抑制剂对吞噬均无显著影响。     

大黄鱼二倍体和三倍体血液生理指标的比较研究

本文对人工诱导的大黄鱼三倍体与正常数大黄鱼二倍体的血液血细胞常值测定,并对血液生理指标进行比较研究。结果表明:体长25.2～29.2cm,体重180.0～331.0g的二倍体大黄鱼,红细胞平均值为2.33±0.12(×1012个/L);白细胞平均值为23.65±2.45(×109个/L);血栓细胞平均值为42.50±7.14(×109个/L)。体长25.2～27.5cm,体重224.0～281.0g的三倍体大黄鱼,红细胞平均值为1.22±0.18(×1012个/L);白细胞平均值为31.19±3.52(×109个/L);血栓细胞平均值为29.25±5.91(×109个/L)。分析比较大黄鱼二倍体、三倍体各项血液生理指标,除血红蛋白无显著性差异外,其余各项血液生理指标有显著性差异。