四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1（Actinidia virus 1，AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性，采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明，22份样品为AcV-1阳性，检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列进行比对，结果表明，分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8% ~ 97.1%和89.7% ~ 99.6%，其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外，其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示，这些分离物主要聚集在3个分支上，分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支，其余分离物位于另外2个分支。     

莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）在江苏省莲藕产区普遍引起发病，并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况，针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R，通过优化引物浓度和退火温度条件，构建标准曲线，建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测技术。该方法特异性强，可以快速检测出SPLV-lotus，灵敏度为普通PCR的100倍，可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析

使用RT-PCR方法从吉林省疑似感染胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的分蘖洋葱(毛葱)叶片中获得了SYSV吉林毛葱分离物SYSV-JL(MN607702)的全基因组序列。SYSV-JL的全长序列为10?427 nt,与GenBank已登录的3条SYSV全长或近全长序列在多个基因上保持着较高的序列一致性,但在P1基因上核苷酸和氨基酸序列一致性较低,分别为69.5%～84.2%和60.9%～76.9%,进一步通过变异分析发现,P1基因包含369个变异位点,表现出较为明显的高变异特征。系统发育分析显示,不同SYSV分离物具有较为明显的地区差异,SYSV-JL分离物与多个中国分离物系统发育关系较近。     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的田间试验

为验证鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)对鸽子的安全性和免疫效果,对试制的5批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)分别在3家规模化养鸽场进行田间试验。结果表明:幼龄鸽、青年鸽和种鸽免疫鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)后均无任何不良反应,并产生了较高的抗体水平,免疫后180 d对鸽副黏病毒Ⅰ型强毒川沙株的攻毒保护率在90%以上。试验效果证明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)安全有效。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒乌鲁木齐分离株GP5基因遗传变异分析

为对乌鲁木齐市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传变异情况进行研究与分析,应用RT-PCR方法对疑似感染PRRSV猪的组织脏器进行PRRSV GP5基因的扩增,将阳性样品PCR产物进行克隆和测序,并应用分子生物学软件对测序结果进行比对和遗传进化分析。结果显示,5株病毒分离株GP5基因全长均为603 bp,与JXA1株亲缘关系较近,同属于美洲株的同一基因亚群。本试验结果为掌握乌鲁木齐市PRRSV的分子遗传变异情况提供了依据。     

RNA干扰对大鲵蛙病毒主要功能基因表达及其增殖的影响

采用q PCR与病毒滴度测定观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)、甲基转移酶(methyltransferases,MTases)、DNA多聚酶(DNA polymerase)基因表达与病毒增殖的影响。结果表明,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能推迟鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini,EPC)出现病变,且病变程度也较对照组轻。在各功能基因表达量上,NC-FAM对照组与阴性对照组差异不显著(P0.05);而干扰组的干扰率极显著高于阴性对照组,其中siR-DP-1组siRNA对MCP基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01);siR-MT-1、siR-MT-2组siRNA对MTases基因的干扰率为77%,极显著高于其余组(P0.01);siR-DP-1组siRNA对DNA polymerase基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01)。干扰实验组病毒滴度与NC-FAM对照组和阴性对照组相比也有不同程度的降低。阴性对照组lg TCID50为8.362,NC-FAM对照组lg TCID50为7.848,siR-MCP、siR-MT、siR-DP实验组最低lg TCID50分别为5.764、5.317、5.362。证实RNAi能够抑制CGSRV主要功能基因的表达并影响病毒的复制。     

北京地区猫杯状病毒和疱疹病毒流行病学调查

为了调查猫杯状病毒(FCV)和疱疹病毒(FHV)在家养猫中的流行情况,对中国农业大学动物医院进行FCV和FHV PCR检测的412例病例进行流行病学调查,结果显示,有呼吸道症状的患猫FCV和/或FHV感染的总发生率为60.2%,其中FHV和FCV的阳性率分别是26.3%和46.3%,混合感染的发生率为11.8%。对性别、品种、年龄因素与FHV和FCV感染的相关性分析显示,家养长毛猫与FHV感染呈显著正相关(P<0.05,OR=3.25),波斯血统猫与FHV感染呈显著负相关(P<0.05,OR=0.32)。其他因素与FCV和FHV感染均无相关性(P>0.05)。症状与FCV或FHV感染的相关性统计显示,FCV感染与打喷嚏和口腔溃疡呈显著相关(P<0.05),而与眼、鼻分泌物、结膜炎和咳嗽等症状无显著相关性(P>0.05);FHV与上述所有临床症状均无显著相关性(P>0.05)。猫的FHV和FCV感染率在北京地区的发病率相对较高,临床中应提高预防意识。