水稻矮缩病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达

【目的】为明确水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达动态,【方法】利用PEG介导的病毒侵染原生质体体系,通过免疫荧光和电镜技术分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒体在水稻原生质体中的定位;同时,通过Western blot和实时荧光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生质体中的积累量。【结果】病毒接种水稻原生质体48 h后,Pns6蛋白在细胞质中可以形成类似于病毒原质(viroplasm)的点状内含体,P8蛋白也大量的表达。同时,病毒粒体在水稻原生质体中也形成内含体状的结构。病毒接种水稻原生质体12 h后,均可检测到Pns6和P8蛋白的表达,并且在36 h后达到最高值。病毒接种水稻原生质体后,Pns6 RNA在24 h时表达量达到最高,P8 RNA在36 h时表达量达到最高。【结论】RDV侵染水稻原生质体后,Pns6和P8蛋白均有表达,并且病毒也可能通过形成病毒原质来完成病毒在寄主细胞的复制和装配。     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的致病性分析

利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体在本氏烟中分别和共同表达了南方水稻黑条矮缩病毒可能编码的6种非结构蛋白(Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91和Pns92),采用实时荧光定量PCR技术分析了其表达水平。结果表明,与PVX空载体侵染的本氏烟相比,只有Pns92蛋白的表达能够表现出典型的花叶症状,6种蛋白共同表达时的症状与Pns92单独表达呈现的症状相似。推测Pns92可能与病毒的致病性有关。     

水稻瘤矮病毒S9基因的生物信息学分析及原核表达蛋白的抗血清制备

以广东德庆市水稻瘤矮病的典型病株为材料,RT-PCR扩增并克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的第9组分全长核苷酸序列。生物信息学分析表明,其基因结构特征与已报道的其他分离物基本一致。Pns9蛋白为细胞膜外蛋白,在植物呼肠孤病毒属内没有发现同源蛋白,与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的入口蛋白(portal protein)及姜氏军团菌(Legionella drancourtii LLAP12)的假设蛋白(hypothetical protein LDG_3259)分别有33%和24%的氨基酸序列相似性,功能尚待确定。将S9基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)得到高效表达,融合蛋白经亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot和ELISA分析表明制备的兔抗为特异抗血清,效价为1∶13 1072。     

水稻黑条矮缩病毒P7-1基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析

【目的】通过在水稻中过量表达水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) P7-1基因,分析RBSDV P7-1是否是导致水稻不育的重要致病因子,并明确过量表达P7-1转基因植株对病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法从感病植物中扩增获得RBSDV P7-1基因,构建pCAMBIA-1300-P7-1载体,通过农杆菌转化法获得转基因水稻,观察水稻是否能够正常结实,并采用人工接种病毒方法分析转基因植株的抗性。【结果】过量表达RBSDV P7-1的转基因水稻生长、结实正常。在接种7 d和14 d时转基因植株中病毒积累量显著低于野生型对照,但在28 d时部分转基因株系中病毒积累量高于对照,接种30 d时转基因植株的发病率与对照无明显差异。【结论】在水稻中过量表达RBSDV P7-1不影响水稻的结实;转基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的积累,但在后期对病毒的抗性与对照没有明显差异。     

水稻锌指蛋白基因OsZFP1的功能分析

生物信息学分析表明,稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶MoSp1在水稻中的互作蛋白OsZfp1,为含有环指结构域的C3HC4型锌指蛋白。对稻瘟病菌侵染过程中OsZFP1基因的表达动态分析表明,OsZFP1基因表达水平在稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液接种水稻后缓慢升高,接种后18h达到最高峰,约为3.8倍,这表明该基因响应稻瘟病菌的侵染。利用改进的农杆菌介导的转基因技术成功获得OsZFP1基因的过表达植株。抗性分析表明OsZFP1过表达植株的整体抗稻瘟病能力得到显著提高。说明OsZFP1基因在水稻抵抗稻瘟病菌侵染过程中扮演着十分重要的角色。     

一个水稻小热休克蛋白的异源表达及寡聚特性分析

【目的】在前期研究中,本实验室已克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),并发现该基因的表达明显受到热激和病毒侵染调控,表明该蛋白可能在逆境胁迫过程中起重要作用。本研究的目的在于进一步明确OsSHSP17.6的特性。【方法】在本研究中,进一步将该基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a并导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,通过亲和层析的方法纯化了该重组蛋白,进一步用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析。【结果】异源表达的重组OsSHSP17.6能减轻IPTG对宿主菌的毒害。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析显示纯化的重组OsSHSP17.6蛋白在体外能形成同源二聚体和寡聚体。【结论】这些结果支持OsSHSP17.6是一个有功能的分子伴侣蛋白并表明该蛋白可能通过形成同源寡聚体的方式参与逆境胁迫反应,这为进一步明确OsSHSP17.6的功能机制奠定基础。     

水稻雌雄不育突变体Osfma2的细胞学观察及基因图位克隆

【目的】通过构建分离群体定位并克隆水稻雌雄不育基因OsFMA2,并对其在水稻育性调控中的功能进行探究。【方法】通过EMS诱变水稻宁粳4号得到稳定的不育突变体,对突变体进行表型及细胞学观察,利用精细定位和Mut-map相结合的方法克隆了水稻雌雄不育基因OsFMA2,通过实时荧光定量PCR检测其在各组织表达水平差异,利用水稻原生质体表达系统进行OsFMA2蛋白的亚细胞定位。【结果】细胞学观察发现突变体为雌雄不育。利用极端个体将其精细定位于水稻第6染色体长臂448 kb的区间内。结合全基因组重测序结果,最终确定OsFMA2为目标基因。该基因编码一个复制蛋白,在单子叶植物中高度保守。OsFMA2具有组织特异性,在幼穗中高表达。亚细胞定位结果显示OsFMA2蛋白定位于细胞核中。【结论】OsFMA2在幼穗中高表达,可能参与了水稻雄配子第一次减数分裂前期同源重组过程,同时,OsFMA2的表达对雌配子发育也产生了不利影响。     

水稻草矮病毒侵染的水稻根系差异蛋白鉴定

为鉴定与水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)侵染引起的水稻根系发育不良的相关蛋白,解析根系发育不良症状的形成机理以及水稻草矮病毒与水稻互作的分子机制,采用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对RGSV侵染水稻后根系的差异表达蛋白进行分离和鉴定,并对鉴定的差异表达蛋白进行GO聚类分析和KEGG生物通路注释。结果表明,差异倍数大于2的蛋白质点有56个,其中,表达丰度升高的点有34个,表达丰度下降的点有22个;质谱成功鉴定出27个蛋白质点,分属于25种蛋白质。GO聚类分析表明差异表达蛋白涉及14个生物学过程,在生物功能上分属10类。细胞组件分析显示差异表达蛋白定位于不同的细胞部位。KEGG通路分析显示差异蛋白参与了12个生物通路。     

水稻小热休克蛋白OsHSP20抗体特性鉴定及应用

【目的】在前期克隆了一个水稻小热休克蛋白(OsHSP20)的基础上,进一步分析该蛋白多克隆抗体的免疫反应特性和应用范围,为深入鉴定该类基因的功能奠定基础。【方法】利用合成多肽和其原核表达产物分别免疫家兔制备了相应的多克隆抗体;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比较多克隆抗体效价和灵敏度;Western blot用于鉴定多克隆抗体的特异性和应用范围。【结果】Western blot分析显示,利用重组OsHSP20蛋白及其合成多肽所制备的多克隆抗体均可以在原核表达OsSHSP样品中特异性检测到1条大小与预期一致(37kD)的条带,表明两种方法获得的多克隆抗体都具有高度的特异性;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明,利用重组蛋白制备的多克隆抗体效价和灵敏度均高于利用多肽制备的抗体。进一步的Westernblot分析显示该抗体可用于多种植物小热休克蛋白(SHSP)的检测。【结论】制备了OsHSP20蛋白质抗体,且具有高度的特异性和较高的效价和灵敏度,可广泛地用于多种单、双子叶植物HSP20蛋白的表达分析,有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鉴定。     

水稻对穗枯病的抗病机理初步研究

【目的】水稻在孕穗期比苗期更容易感染穗枯病(Bacterial panicle blight of rice)并出现病症。本研究旨在探究水稻不同时期对穗枯病的抗性机理,为培育抗病水稻品种奠定基础。【方法】采用喷雾法和注射法分别对苗期和孕穗期的抗、感病水稻品种接种颖壳伯克氏菌(Burkholderia glumae),测定处理组与对照组的3种抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活性的差异,并利用实时荧光定量PCR测定5种防卫反应基因(PR1a、PR10b、Rcht、LOX、PAL)的表达量。【结果】B.glumae的侵染能引起水稻活性氧的积累,提高抗氧化酶活性,使部分防卫反应基因大量表达,但是苗期和孕穗期的应答有较大区别。水稻孕穗期的抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性和防卫反应基因(PR10b、Rcht和PAL)的表达量比苗期高,但PR1a和LOX的表达量却低于苗期。【结论】B.glumae能诱导孕穗期的水稻产生更多抗病反应,参与抗病反应的主要是水杨酸信号传导途径。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

转Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比较转录组分析

【目的】在转录水平上解析Pi9基因介导的稻瘟病抗性调控机理,为培育抗病水稻品种提供理论依据。【方法】向水稻品种日本晴(NPB)及其转Pi9抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接种稻瘟菌。分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h提取叶组织样品,选取12503个水稻基因定制基因芯片,进行水稻基因转录组分析,并通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。【结果】NPB/Pi9在接种后12 h、24 h和36 h的基因表达量分别与其接种0 h表达量比较,共检测到7754个差异表达基因;相应地,感病水稻NPB在以上时间点共检测到7385个差异表达基因;在接种后36 h,NPB/Pi9的差异表达基因数目显著多于NPB。比较NPB/Pi9和NPB相同时间点的基因表达量,共获得4065个差异表达基因,其中接种后36 h的差异表达基因显著多于接种后0 h、12 h或24 h。因此,NPB/Pi9的稻瘟病防御反应更强烈。对NPB/Pi9与NPB相同时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析,细胞外区域、植物对刺激应答、转录调控、氧化还原、离子结合、次生代谢和植物激素相关的GO分类在接种后呈显著富集,苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成和植物激素信号途径的KEGG通路在接种后显著富集。与效应分子触发的免疫反应(ETI)相关的水杨酸信号途径、几丁质酶,以及与病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)相关的胞外区域、对刺激的应答、木质素合成等,均在抗感水稻之间差异表达。而且PTI/ETI共有的WRKY转录因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信号途径等发生差异表达。综上所述,NPB/Pi9和NPB的差异表达模式与ETI和PTI相关,两者相互联系并在Pi9介导的稻瘟病抗性中发挥作用。【结论】与日本晴比较,抗病基因型NPB/Pi9对稻瘟病防御反应更强烈。转录因子、激酶、NBS-LRR基因、几丁质酶、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径,以及植物次生代谢在Pi9介导的稻瘟病抗病反应中发挥重要作用。     

水稻矮缩病毒对介体昆虫黑尾叶蝉生物学参数及种群增长的影响

【目的】 水稻矮缩病毒(RDV)是水稻普通矮缩病的病原。该病害主要依赖于黑尾叶蝉经卵以持久增殖方式传播,危害水稻。本研究旨在明确RDV对黑尾叶蝉存活、发育、繁殖和种群增长的影响,分析病毒对介体昆虫的间接影响。【方法】 采用室内实验比较了黑尾叶蝉在健康水稻及感病水稻上的发育繁殖情况,组建了实验种群生命表,并调查了RDV对种群增长的影响。【结果】 与健康水稻相比,感病水稻上叶蝉若虫期存活率更高,雌若虫发育历期显著缩短,雄成虫寿命显著延长,产卵量显著增加,其他生物学参数无显著差异。五个生命表参数仅净生殖率(R₀)存在显著差异,感病水稻上叶蝉R₀显著高于健康水稻。饲喂感病水稻的养虫笼内叶蝉种群增长更快,总成虫数量更多,在接虫后的第4、5和6月显著高于健康水稻上的数量。【结论】 水稻矮缩病毒可以提高黑尾叶蝉的存活率和产卵量,并促进种群的增长。     

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

水稻胚乳组织的结构观察

【目的】阐明水稻糊粉层细胞、亚糊粉层细胞与中心胚乳贮藏细胞的结构特性。【方法】采用光镜、透射电镜与扫描电镜对水稻胚乳组织进行观察研究。【结果】糊粉层细胞分化过程中,大液泡变成小体积蛋白贮存液泡,蛋白贮存液泡又转变成糊粉粒。颖果背部比腹部有更多层糊粉层,但背部糊粉层细胞内糊粉粒的形成与积累速度却较慢。亚糊粉层细胞起初含有一些脂质体,后来脂质体消失,而其内部淀粉体与蛋白体逐渐增多。中心胚乳贮藏细胞含有淀粉体与蛋白体,蛋白体以液泡型蛋白体为主,它们可以相互融合而变大。中心胚乳贮藏细胞内的淀粉积累速度明显快于亚糊粉层细胞内的。成熟颖果的中心胚乳贮藏细胞内淀粉体最为密集,背部和侧部的亚糊粉层细胞内淀粉体排列较疏松,腹部的亚糊粉层细胞内淀粉体最为稀疏。【结论】水稻颖果背部与腹部的糊粉层细胞和亚糊粉层细胞的结构差异可能与养分吸收与转运有关;中心胚乳贮藏细胞内淀粉体发育速度快于亚糊粉层细胞。     

Extracellular Antimicrobial Substances Produced by Bacillus subtilis JN005 and Its Control Efficacy on Rice Leaf Blast

【Objective】The purpose of this research is to assay stability, biological activity and efficacy of the extracellular antimicrobial substances produced by Bacillus subtilis JN005 against Magnaporthe oryzae. 【Method】The antimicrobial substances produced by B. subtilis JN005 was tested using different media. The activity of extracellular antimicrobial substances of JN005 strain against M. oryzae and its efficacy on rice leaf blast were measured by dural culture, optical microscope observation, indoor detached-leaf inoculation and live inoculation.【Result】B. subtilis JN005 secreted protease, cellulase, amylase and β-1,3-glucanase and its extracellular antimicrobial substances showed inhibition activity against M. oryzae. The extracellular antimicrobial substances were stable in a wide range of pH values from 2 to 12 and at temperatures from 0℃ to 100℃. The antifungal activity was retained after treatment with proteinase K. The extracellular antimicrobial substance kept its activity even it was irradiated for 12 h under ultraviolet light or exposed to 4℃ for 3 months. The extracellular antimicrobial substances caused distortion of hyphae of M. oryzae, and hindered the germination of conidia. Indoor detached leaves inoculation of Xiangwanxian 12 showed that disease incidence was 34.07% as rice leaves were treated with 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances, followed by inoculation with conidia suspension of M. oryzae (after 24 h). The control efficacy was close to that of 500 times-diluted 40% isoprothiolane EC. The disease incidence was 38.52% as rice leaves were inoculated with conidia suspension of M. oryzae and treated with 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances after 24 h, significantly different from 1500 times-diluted 75% tricyclazole WP and 500 times-diluted 40% isoprothiolane EC. The potted plant experiment showed that efficacy was 75.32% as rice was inoculated with conidia suspension of M. oryzae followed by spraying 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances before 24 h. The efficacy was 71.49% as rice was inoculated with conidia suspension of M. oryzae and followed by spraying of 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances after 24 h.【Conclusion】The extracellular antimicrobial substances produced by JN005 strain directly inhibited mycelial growth and conidia germination of M. oryzae and it has good environmental stability. The extracellular antimicrobial substances have better preventative efficacy and therapeutic efficacy on rice blast and should be further investigated and developed as such.