辣椒(Capsicum annuum L.)热休克因子家族(CaHsfs)全基因组分析、表达谱分析及CaHsfA2的鉴定

背景:热休克因子(Hsf)在植物生长和防御过程中具有重要作用。辣椒(Capsicum annuum L.)是重要的蔬菜作物,其产量和质量受高温、盐渍及渗透胁迫等环境胁迫影响而严重降低。尽管辣椒基因组测序已经完成,但Hsf家族在非生物胁迫条件下的作用尚不明确。结果:通过生物信息学分析及PCR检测,在辣椒基因组中共鉴定出25个CaHsf。根据Hsf的保守结构域,CaHsf可分为3类,分别是CaHsf A、CaHsf B和CaHsf C;除第11号染色体外,该家族基因在其他11条染色体上均有分布;除CaHsf A5外,该家族蛋白均能形成蛋白互作网络。据辣椒栽培种CM334的转录组数据,大部分CaHsf基因在根、茎、叶、果皮、胎座等组织中不止一处表达。q RT-PCR表明,除耐热株系R9叶片中的CaHsfC1外,所有CaHsf均响应高温胁迫(40℃,2 h);且其表达模式与热敏株系B6的CaHsf表达模式不同。许多CaHsf也受到盐胁迫、渗透胁迫、外源Ca~(2+)、腐胺、ABA和茉莉酮酸甲酯的调控。此外,CaHsfA2定位于细胞核,且具有转录活性,具有Hsf的典型特征。随时间变化,CaHsfA2响应高温胁迫的表达谱表明,CaHsfA2在辣椒热敏株系B6与耐热株系R9中的表达模式与表达水平均不相同。结论:从辣椒基因组中鉴定了25个Hsf,多数响应高温胁迫、盐胁迫、渗透胁迫及外源物质,为进一步研究辣椒CaHsf在各非生物胁迫中的功能及相应的信号转导途径奠定了基础。     

苹果赤霉素信号转导因子MdGAMYB的克隆和表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,从其短枝顶芽中克隆得到1个赤霉素信号转导因子MdGAMYB,对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,MdGAMYB的开放阅读框(ORF)长度为1 656bp,编码551个氨基酸,蛋白质分子量为59.741 kD。生物信息学分析表明MdGAMYB编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点;序列分析表明,Md GAYMB和其他物种的GAMYB蛋白有很高的相似性,均含有保守的R2R3 DNA结合域和GAMYB家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域;系统进化分析表明,Md GAYMB与梨、梅花、草莓、枣和葡萄等的GAMYB蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Md GAYMB具有组织表达特异性,在叶片、花和芽中的表达量较高。外源GA3处理抑制了花芽孕育和翌年成花,抑制MdGAMYB的表达。在易成花品种‘烟富6号’中的表达量高于难成花品种‘长富2号’。     

利用钾吸收基因表达评价葡萄叶面喷施钾肥效果和喷施浓度

【目的】叶面喷施钾肥可以快速、 高效地为葡萄补充钾营养,促进葡萄的高产和优质,已经被广泛应用于葡萄生产中。本实验通过对葡萄叶面喷施不同种类及浓度钾肥,测定葡萄叶片和果实等生理指标变化,以及钾吸收相关基因的表达变化,从生理和基因水平上评价这些钾肥的喷施效果,为葡萄生产中钾肥的施用提供一定指导。【方法】本实验以‘夏黑’葡萄为试材,选择两个葡萄生长关键时期盛花期和果实膨大期分别对葡萄叶片喷施0.2%、 0.5%和0.8%三种浓度的K2SO4、 K2CO3、 K2SO4·2MgSO4和KCl。然后对葡萄叶片和新梢的生长率,坐果率,叶绿素含量,单粒重,可溶性固形物等生理指标进行统计分析,并利用荧光定量PCR技术分析4个钾吸收相关基因VvHAK13、 VvKEA2、 VvSIRK和VvSORK的表达情况。【结果】叶面喷施4种钾肥后,葡萄叶片和新梢的生长率,坐果率,叶绿素含量,单粒重,可溶性固形物等各项生理指标均有不同程度的提升。钾肥种类不同,最适喷施浓度不同,同种钾肥在葡萄盛花期和果实膨大期的最适喷施浓度也有所不同,四种钾肥在果实膨大期的最适喷施浓度普遍高于盛花期。四个钾吸收相关基因在喷施不同种类及浓度钾肥后也表现出不同的表达模式,总体来讲VvKEA2、 VvSIRK 、 VvSORK的表达上调,而VvHAK13的表达下调。果实膨大期,需喷施较高浓度的钾肥,钾吸收相关基因才表现出较强烈的响应,而在盛花期则只需喷施较低浓度的钾肥。综合生理指标和基因表达两方面结果,得出4种钾肥效果依次为K2SO4·2MgSO4＞K2SO4＞K2CO3＞KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施浓度为0.5%,K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2%; 果实膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.5%,K2CO3的最适喷施浓度为0.8%。【结论】葡萄叶面喷施钾肥可以有效促进葡萄叶片和果实的生长发育,四种钾肥的效果依此为: K2SO4·2MgSO4＞K2SO4＞K2CO3＞KCl。盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施浓度为0.5%,K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2%; 果实膨大期K2SO4、 K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.5%,K2CO3的最适喷施浓度为0.8%。适宜的喷施浓度可以有效提高钾吸收相关基因的表达,是其提高钾吸收利用的机理之一。     

低温胁迫下马铃薯的数字基因表达谱分析

以马铃薯品种合作88为材料,利用数字基因表达谱(DGE)技术,对–2℃低温胁迫处理后的马铃薯叶片c DNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明,有28 505个基因受低温胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因13 703个,下调表达基因14 802个。GO功能显著性富集分析表明,DEGs主要涉及信号生物代谢过程、氧化还原过程、能量代谢、次生代谢过程以及催化活性。KEGG富集分析表明,上调表达基因主要富集于苯丙烷、光合作用天线蛋白、类胡萝卜素的生物合成、苯丙氨酸代谢及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物激素信号转导途径。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证4个DEGs在低温胁迫条件下的差异表达,其结果与DGE分析结果基本一致,证实了DGE测序结果的可靠性。     

单毛囊RT-PCR技术在哺乳动物毛囊基因表达研究中的应甩

为了研究单毛囊RT-PCR技术在哺乳动物的毛发基因表达中的应用,试验以人的毛发为研究对象,利用单毛囊RT-PCR技术体系在1根头发的毛囊相关基因表达中成功地获得目的基因片段,经测序证实为目的基因片段.结果表明:该技术体系在研究毛囊相关基因的表达中取得了理想的结果.试验体系可以用于活体微创条件下研究毛囊相关基因的表达分析...     

霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析

采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原.     

香蕉TGA转录因子家族的鉴定及枯萎病菌胁迫下的表达分析

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense, Foc）引起的香蕉枯萎病是我国香蕉的主要病害之一,严重影响香蕉的产量和品质。TGA防御反应基因在香蕉应对尖孢镰刀菌胁迫的应答转录调控过程中至关重要。本研究以拟南芥TGA转录因子家族成员蛋白为查询序列,在香蕉基因组数据库中Blast筛选出TGA转录因子家族成员,并对该家族成员进行生物信息学分析。共鉴定得到9个香蕉TGA家族成员,分别命名为MaTGA1~MaTGA9;香蕉TGA家族蛋白富含酸性氨基酸,大部分蛋白以α螺旋为主;亚细胞定位主要在细胞核内。进化树分析表明,香蕉MaTGA转录因子家族的9个成员可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类,基因结构及功能结构域的分布情况也呈现出高度一致。进一步通过RT-qPCR分析发现,MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉枯萎病菌侵染后的‘威廉斯’（易感病）及‘南天黄’（抗病）中均显著下调表达,MaTGA1、MaTGA6、MaTGA7和MaTGA9均呈现先下降后上升的趋势;然而MaTGA4和MaTGA5仅在‘威廉斯’中上调表达,以上结果表明MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉抗枯萎病中发挥重要的生物学功能。本研究结果为香蕉TGA转录因子功能挖掘奠定理论基础。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH克隆及表达

通过Solexa技术和比较基因组学方法鉴定霜霉威胁迫下黄瓜果实差异表达基因,筛选黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH。研究利用PCR克隆获得SDH基因全长,命名为Cs SDH。构建亚细胞定位表达载体,利用农杆菌浸润法注射烟草叶片后激光共聚焦显微镜下观察;分别用荧光定量RT-PCR方法和酶联免疫法研究高、低农残品系D9320和D0351中Cs SDH基因在农药霜霉威处理后,不同时间点、不同组织部位时空表达特征和琥珀酸脱氢酶活性。结果表明,Cs SDH基因在烟草叶片细胞中被定位在细胞膜上。黄瓜低农残品种D0351中,Cs SDH基因在果实受霜霉威胁迫后反应迅速,主要在处理前期响应表达强烈,琥珀酸脱氢酶活性显著增加,且该基因表达量显著高于其在高农残品种D9320中表达量。Cs SDH果、叶中表达量较茎中高,且各组织部位表达量高低顺序稳定,为叶果茎。黄瓜高农残品种D9320中,Cs SDH基因表达量在0.5、1、3、12 h呈现上调表达,6、9 h基因表达量差异不显著,48 h出现上调表达高峰。说明克隆得到的Cs SDH基因属农药处理前期响应基因,且该基因可能在降低黄瓜农药残留过程中发挥重要作用。试验通过研究黄瓜琥珀酸脱氢酶基因(SDH)在霜霉威胁迫下表达情况,为挖掘黄瓜低农药残留性功能基因以及探明其作用分子机制奠定基础。     

‘鸭梨’钙调素基因的克隆与表达分析

以‘鸭梨’为材料,用RT-PCR及RACE技术克隆CaM,并借助实时定量PCR技术分析‘鸭梨’花、叶及果实不同发育时期的表达模式,获得了2个长度为764和801bp的CaM cDNA序列,分别命名为PbCaM1和PbCaM2,二者均含有450bp完整开放阅读框,编码149个氨基酸,且氨基酸序列相同。‘鸭梨’CaM在系统进化上具有高度保守性,与苹果相比,两者氨基酸序列为100%一致性。PbCaM1和PbCaM2具有时空表达特异性,它们在成叶、盛花期花瓣和幼果期表达量较高。本研究表明CaM具有高度保守性,PbCaM1和PbCaM2在‘鸭梨’果实早期生长发育过程中起着非常重要的作用。