呼伦贝尔地区猪源大肠杆菌血清型鉴定与耐药基因检测

为了解呼伦贝尔地区猪大肠杆菌血清型与耐药基因情况,研究于2013~2014年从8个规模化猪场分离、鉴定出108株致病性大肠杆菌。对分离菌株进行血清型鉴定,确定以O8、O9、O149、O157为主,分属8个血清型的97株大肠杆菌菌株。研究采用PCR方法检测四环素类耐药基因(tet A、tet B、tet C、tet D)、大环内酯类耐药基因(erm B、erm C、erm F)、以及β-内酰胺类耐药基因(bla SHV-1、bla CTX-M、bla TEM)共10种耐药基因。结果显示,108株分离菌株中检测出5种耐药基因(tet A、tet B、erm B、bla CTX-M、bla TEM),与Gen Bank中相应基因有很高的同源性。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株（GenBank登录号：CP002465.1）同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_TEM、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet（B）、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。     

东北地区土壤中4株Bt菌株的研究

对从东北地区土壤中分离出的4株编号分别为HB-4、HB-11、HB-37和HB-69的苏云金芽孢杆菌菌株进行了形态特征、发酵特性、生化反应、鞭毛血清型鉴定及毒力测定的研究。结果表明,4株菌株的血清型分别为:H3abc、H14、H5ab和H3abc。4株菌株对小菜蛾均有较高毒力,HB-37对玉米螟有较高毒力,HB-4对玉米螟有低毒,HB-11对尖音库蚊有低毒。     

伊莎明星肉鸡(纯系)血清酯酶、碱性磷酸酶以及转铁蛋白多态性的分析

本试验分析了伊莎明星肉鸡A,B,C,D,E等5个纯系的血清酯酶、碱性磷酸酶同工酶以及血清转铁蛋白的多态性。结果表明;伊莎明星肉鸡各系的碱性磷酸酶均以F型表现型频率为高,但各系间存在一定差异。父系A和B的F型频率要高于母系C,D和E;转铁蛋白类型在A系较为特殊,其Tf~A基因频率高于Tf~B型,其余四系B,C,D和E均为Tf~B频率最高。在母系C和E中存在较为少见的Tf~C基因;用醋纤薄膜电泳分离血清酯酶,山于灵敏度较低,加上血清酯酶受性别的强烈影响,使雌性个体出现无带型的O带,因而难以准确分析其基因型。试验证明血清酶型和血清蛋白型可作为探讨系间亲缘关系的有效手段。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用

PCR是一种体外核酸扩增技术 ,具有敏感性强、特异性高、快速、简便等优点 ,在医学、生物学等领域中得到了广泛应用。文章系统地阐述了PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用 ,并对引物基因设计、PCR扩增过程中的技术参数和常见疑难问题做了归纳总结。同时简要介绍了PCR技术的研究进展 ,展望了今后微生物检测的发展方向     

2型猪链球菌烯醇化酶的原核表达及其对体外血脑屏障模型通透性影响的检测

通过原核表达的方式获得能在多种病原茵表面表达的烯醇化酶（Enolase,Eno）,探索Eno在脑膜炎致病过程中的作用。根据GenBank上公布的基因序列设计Eno特异性引物,通过PCR技术扩增2型猪链球菌（Streptococcussuis serotype2,SS2）的Eno基因序列,克隆到pMD18-T载体,进-步亚克隆到原核表达载体pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—Eno,转化入大肠杆菌BL21CodonPlus（DE3）感受态中诱导表达,经镍离子螯合柱纯化后,检测其对体外血脑屏障模型通透性的影响。结果显示,经1mmol／LIPTG诱导5h为最佳诱导条件,目的蛋白约54000,与预期蛋白大小相符合;纯化的蛋白Westernblotting分析表明,其具有较好的免疫原性;Eno可致体外血脑屏障模型通透性增加。结果表明,Eno作为SS2潜在的毒力因子在SS2引起脑膜炎的致病过程中起到重要的作用。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

2011~2013年间,从山东省、河北省和江苏省等地的多个貂场疑似水貂出血性肺炎病貂的肺脏、肝脏和脾脏中分离到425株疑似绿脓杆菌。用绿脓杆菌的OprF和PEA基因的PCR引物对分离菌株的目的基因扩增,经核苷酸测序确定其均为绿脓杆菌序列。通过日本生研株式会社血清学分型系统进行分型：G型376株,占88.5%;B型34株,占8%;C型12株,占2.8%;E型3株,占0.7%。取其中6株细菌（G血清型3株,其他血清型各1株）进行详细生化试验,结果显示该6株菌均符合绿脓杆菌的生化特性,并且从这6株中选4株细菌（每血清型各1株）腹腔接种小白鼠和气管内接种水貂,结果表明4株菌对其均有致病性。     

2007-2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

采用PCR血清型鉴定方法,对2007-2012年从广西、广东、海南、福建和云南等地养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus中分离获得的168株无乳链球菌Streptococcus agalactiae流行菌株的血清型进行分析。结果表明：有159株为Ⅰa血清型,6株为Ⅰb血清型,3株为Ⅲ血清型。各区域流行菌株血清型也存在差异：从广西自治区7个地区50个养殖场的罗非鱼中分离的61株无乳链球菌中,有54株为Ⅰa型,4株为Ⅰb型,3株为Ⅲ型;从广东省10个地区59个养殖场的罗非鱼中分离的64株无乳链球菌中,有63株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从海南省5个地区26个养殖场的罗非鱼中分离的33株无乳链球菌中,有32株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从福建省漳州6个养殖场的罗非鱼中分离的6株和从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4株均为Ⅰa型。研究表明,2007-2012年中国罗非鱼链球菌病流行菌株血清型存在Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型,Ⅰa型为主要血清型,研究结果可为准确分析中国罗非鱼链球菌病流行规律和特点提供数据,为该病防治及疫苗候选菌株筛选提供理论基础。