于线粒体COI基因的6个黄鳝群体遗传多样性

为研究我国主要养殖区域黄鳝（Monopterus albus）的遗传多样性,利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）基因对来源于湖北、江西、安徽、湖南、重庆和山东的6个黄鳝群体共187个样本进行遗传多样性分析。结果表明长度为646 bp的COI基因序列在6个群体的碱基含量基本相同,碱基T、C、A和G的平均含量分别为27.7%,30.7%,24.5%和17.1%,包括61个变异位点,其中单位点突变16个,简约信息位点45个,变异位点以C/T间的转换为主。6个群体中共检测到38种单倍型,单倍型多样性（H_d）为0.886,核苷酸多样性（π）为0.01094,群体整体遗传多样性高,湖北和山东群体遗传多样性都较高（H_d>0.8）,湖南群体和江西群体的遗传多样性次之（H_d>0.5）,而安徽和重庆两个群体的遗传多样性都较低（H_d<0.5）。6个群体间有显著的遗传分化,基因交流贫乏（N_m<1）。群体分子变异分析（AMOVA）显示,6个黄鳝地理种群群体内的遗传变异高于群体间的遗传变异,其遗传变异主要发生在群体内部。遗传结构和系统发育树显示湖南群体与其他5个群体的遗传关系较远。重庆群体可能由单一或很少几个群体进化而来的,起源比较单一。就目前而言,黄鳝野生种质资源遗传多样性丰富,苗种频繁流动和人工养殖尚未对其种群结构造成较大影响,仍有较强的环境适应能力和良好的育种潜力。     

濒危植物巴东木莲ISSR分子标记技术体系的建立

利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的ISSR-PCR分子标记技术体系.对影响ISSR-PCR反应的多个因素,包括引物和DNA模板浓度、Taq酶用量、Mg2 和dNTPs浓度以及PCR扩增的退火温度、退火时间及循环次数等进行了优化.结果表明,适于巴东木莲ISSR-PCR反应的分子标记技术体系为:反应总体积20μ1,含2μ1 10×buffer、1μ1 20 mmol/L Mgcl2、4μ1 2 pxaoL/L引物、0.4μ1 10 mmoL/L dNTPs、0.8μ1 5 u/μ1Taq酶及40 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94 oC变性30 8,54 oC复性45 s,72℃延伸1.5min,35个循环,最后72℃延伸7 min.本研究建立的ISSR分子标记技术体系稳定性强,重复性高.     

巴东木莲DNA的提取及SRAP-PCR反应体系的正交优化止父优化

研究确定了提取巴东木莲基因组DNA的方法．采用正交试验设计法对影响SRAP—PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量、Mg^2＋和dNTPs浓度及PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了比较、优化,同时对DNA模板浓度进行了筛选。结果表明,Mg^2＋、dNTPs、砌酶及引物的不同水平均对PCR反应结果有显著的影响。建立了巴东木莲20μL SRAP—PCR的反应体系为1xbuffer、Mg^2＋浓度为2．0mmol&#183;L^-1、dNTPs浓度为0．25mmol&#183;L^-1、引物浓度为0．45μmol&#183;L^-2、Toq酶为O．5U和模板DNA40ng。适宜的扩增程序为94℃预变性1min,94℃变性1rain,33℃复性1min,72℃延伸1min,10个循环;94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72℃延伸5min。试验表明,该体系重复性好、稳定性强．     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

珍稀濒危植物香果树RAPD反应条件的优化

以采自湖北省神农架地区的14株香果树Emmenopterys henryi为材料,提取其叶片基因组DNA,并以其基因组DNA为模板进行随机扩增多态性DNA(RAPD)反应条件的优化。RAPD反应条件中的各个因子,包括模板DNA质量浓度、引物浓度、dNTP浓度、DNA聚合酶浓度和Mg2 浓度。结果表明,香果树基因组DNA在以下条件有较好的扩增效果:25μL体系中,Taq酶1.33×10-3kat.L-1;随机引物0.5μmol.L-1;Mg2 2.6 mmol.L-1;dNTP 220μmol.L-1;DNA模板4.40 mg.L-1。聚合酶链式反应(PCR)程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,43℃退火1 min,72℃延伸2 min,经过40个循环,最后72℃延伸8 min。此体系和反应程序可获得比较稳定的扩增结果。图6表1参8     

珍稀植物香果树植株再生体系的建立

通过不定芽直接再生和经愈伤组织诱导器官发生两种途径,建立了香果树快速、高频率发生的植株再生体系,探讨了不同外植体（幼叶切块、茎段、叶柄和根）、叶片放置方式、植物生长调节剂和培养条件对不定芽直接再生和愈伤组织诱导器官发生的影响.香果树愈伤组织诱导器官发生结果表明:不同外植体在MS附加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L 2,4-D的培养基上愈伤组织诱导率均为100%,其中叶片外植体叶面向下放置效果最好;愈伤组织在MS添加0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的培养基上不定芽的分化率为94.35%.香果树不定芽直接再生结果显示:叶片外植体在MS添加6-BA或ZT的培养基上,不定芽直接再生率均高达100%,其中在MS附加2.0 mg/L 6-BA培养基上,产生的不定芽数目多,生长旺盛;附加1.0 mg/L ZT 培养基上,不定芽数目多达56.67个/cm[[sup]]2[[/sup]],但生长较弱.黑暗预培养有利于香果树叶片外植体不定芽的再生.两种途径得到的不定芽转到1/2 MS培养基上均可生根,生根率达100%,附加1.0 mg/L 的IBA和0.5%的活性炭有利于再生植株根的生长.      

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin,SS)基因cDNA全长序列,分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律。【方法】以黄颡鱼脑组织为材料,根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列,再根据中间保守区序列设计2对引物,分别用于扩增5′端和3′端序列,将扩增得到的中间保守区序列、5′端和3′端序列拼接后得到黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较,并构建系统发育树。用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段（1～20 d）的表达特征。采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征。【结果】黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp,其中5′端非翻译区139 bp,3′端非翻译区211 bp,开放阅读框为345 bp,编码114个氨基酸。黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高,为98%。系统发育树结果显示,黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支。SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达,并持续至胚胎孵化出膜,且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);在出膜后的1～20 d,SS基因在黄颡鱼中稳定表达;在成鱼的各个组织中,SS基因只在脑组织中特异性表达。【结论】初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律,推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能。     

人工雌核发育鲢近交F_2微卫星DNA变异分析

采用17对鲢微卫星引物,以野生鲢、养殖鲢、雄鲤作对照对人工雌核发育鲢近交F2及其亲本进行了微卫星分析。结果表明:人工雌核发育鲢近交F2、养殖鲢和野生鲢群体的平均等位基因数范围为2.1～4.0;平均观测杂合度范围为0.2762～0.9588;期望杂合度范围为0.2774～0.7360;遗传多样性指数范围为0.4500～1.2258,人工雌核鲢近交F2为0.4500,显著低于养殖鲢(1.0273)和野生鲢(1.2258),揭示人工雌核发育鲢近交F2遗传多样性水平较低,纯合度较高。从遗传距离来看,人工雌核发育鲢近交F2与对照群体之间的遗传距离都要大于野生鲢与养殖鲢群体之间遗传距离,表明人工雌核发育鲢近交F2发生了一定程度的遗传分化。     

长丰鲫c型溶菌酶基因的克隆及其在细菌感染条件下的表达分析

为了解c型溶菌酶基因与长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus)的抗菌效应关系,本研究利用同源克隆方法获得长丰鲫c型溶菌酶基因cDNA全长序列。结果显示:c型溶菌酶基因全长698 bp,包括5'端非翻译区60 bp,3'端非翻译区200 bp,开放阅读框438 bp,编码145个氨基酸。长丰鲫c型溶菌酶基因在肾脏组织中表达量最大,在脾脏、肠道、心脏和脑中大量表达,在肝脏和鳃中表达量相对较低,在皮肤和肌肉中几乎不表达。长丰鲫在感染迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌后,在肝脏、肾脏、脾脏和鳃等组织中基因表达量均发生显著变化,出现不同程度的上调。感染迟钝爱德华氏菌后,在脾脏中的上调幅度最大,其次为鳃、肝脏和肾脏;感染嗜水气单胞菌后,在脾脏中上调程度最大,其次是鳃;感染金黄色葡萄球菌后,在脾脏中上调幅度最大。在肝脏和肾脏中,经金黄色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上调幅度最高;在脾脏和鳃中,经嗜水气单胞菌感染后c型溶菌酶基因上调幅度最高。三种刺激后,c型溶菌酶基因升高幅度的不同,说明不同刺激使鱼体组织产生的应激反应能力不同。