动作电位控制的韧皮部物质卸出

对于敏感植物如含羞草(Mimosa pudica),当触摸叶片时,能激起叶枕运动细胞的膨压降低,动作电位上升,导致叶片合拢,刺激后,这些电位通过韧皮部运输对叶枕韧皮部物质卸出产生影响.利用放射性自显影的方法通过“C 物质(CO_2)观察韧皮部的位置,在未受刺激的叶枕,放射性物质显示的图象仅在韧皮部;然而,刺激后的叶枕~(14)C 物质主要集中在皮层的可伸长区域.由于刺激产生动作电位,因而认为,叶枕动作电位导致韧皮部糖类物质卸出.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆与表达

根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列设计合成了一对引物AI-N1/AI-N2,利用RT-PCR方法扩增AIVNS1基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,与GenBank中收录的其他分离株NS1基因进行序列比较分析,同源性达96%~99%,含有NS1基因的1个开放性阅读框(ORF)。将该基因克隆到pET-28a中构建NS1基因原核表达质粒pET/NS1,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达,所表达的蛋白质分子质量约为30kD。Western-blotting结果表明表达的NS1蛋白有良好的生物学活性,与H5N1 AIV感染鸡血清发生特异性反应,而与H5N1 AIV灭活疫苗免疫鸡血清无反应,为建立区分野毒AIV感染家禽与AIV灭活疫苗免疫家禽ELISA方法的建立提供了生物学材料。     

荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立及应用

gag基因是禽白血病病毒(ALV)的群特异性基因,根据GenBank中登录的gag基因的保守序列(E46390),设计合成了1对引物,建立了基于SYBR GreenI模式的检测禽白血病病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法只对目的基因有扩增,对其它无关病毒核酸无特异性扩增;扩增效率为94.6%;在8.2×102～8.2×107拷贝的范围内有很好的线性关系(Y=3.46X+31.8,r=0.9995);最低可检测82个拷贝的病毒核酸,与普通PCR方法相比,灵敏度高出1000倍。组内CV为0.28%～1.45%;组间CV为2.13%～3.84%;对151例临床疑似样本的检出率为54.9%(83/151)。随机选择15份阳性样本PCR产物克隆测序,结果证明扩增片断为ALV的特异序列,与ALVgag基因核苷酸同源性为97.8～98.9%;对重庆14个县的14个健康商品蛋鸡群的134份粪便棉拭子进行检测,ALV的检出率为38.1%,鸡群的阳性率为14/14。同时用实时RT-PCR方法和ELISA方法对从种鸡场随机采集的30份100日龄蛋鸡的血清进行检测,实时RT-PCR检测率为5/30,ELISA方法检测率为4/30。本方法的建立为禽白血病的快速诊断、大规模检疫、监测、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。     

禽流感免疫鸡不同途径攻毒后病毒分离试验报告

目前,对于禽流感防控,灭活疫苗最为安全有效,然而在对高致病性禽流感疫苗免疫效力的评价上,国内外均以控制临床症状为标准,在对抗感染方面报道较少。试验对不同抗体水平的鸡,采用不同途径攻毒进行病毒分离,研究免疫鸡抗体水平与抗感染的平行     

猪瘟组织灭活疫苗与猪瘟弱毒冻干活疫苗免疫效力的比较

对猪瘟组织灭活疫苗的制备方法进行了研究，并就其免疫效力与猪瘟弱毒冻干活疫苗进行了比较。结果表明，接种猪瘟组织灭活疫苗的猪群所产生的抗体水平比接种猪瘟弱毒冻干活疫苗的猪群抗体水平高1～2个稀释度，而且高效价的抗体持续期较长。     

鸡传染性鼻炎不同佐剂灭活疫苗免疫效力对比试验

鸡传染性鼻炎(Infectious Coryza简称IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilus Paragallinarum简称HPg)引起的鸡上呼吸道性疾病。近几年来呈流行趋势，对养禽业造成极大的经济损失，主要表现肉鸡淘汰率增加，蛋鸡产蛋率下降10％～40％。     

禽流感病毒(H5N1)NA基因的克隆及其真核表达载体的构建

本研究克隆了一株鸡源AIVH5N1亚型PQ分离株的NA基因,并对其进行了序列分析。结果表明NA基因开放阅读框架内含有1350个核苷酸,编码449个氨基酸。NA基因与发表的H5N1亚型毒株HKYU的核苷酸和氨基酸同源性分别为89%~98.4%和91.5%~98.7%。PQ分离株的NA茎部有20个氨基酸的缺失,从而使50、58、63、68位糖基化位点丢失。NA基因定向亚克隆入杆状病毒Bac-to-Bac系统的转移载体pFast BacDual中,经酶切和PCR鉴定为阳性的重组转移载体再转化入含有杆粒和辅助质粒的DH10BacTM菌中,与杆粒DNA在细菌内进行同源重组。以M13为引物,用PCR方法鉴定重组杆粒DNA,结果证明成功构建了表达NA基因的重组杆状病毒表达载体。     

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h.