茶树黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的克隆及功能分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是类黄酮代谢途径中的关键酶。本研究采用逆转录PCR技术,获取了茶树(Camellia sinensis)F3H的开放阅读框(open reading frame,ORF)包含1 107个碱基,编码含有368个氨基酸的蛋白质,推测分子量为41.46 kD,等电点为5.61;实时荧光定量PCR表明,CsF3H在叶片中表达量较高,且受光照影响;将此基因重组到表达载体PRSF上,导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行原核表达,优化原核表达的条件,结果表明,最佳诱导温度28℃、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间5 h;利用高效液相色谱法(HPLC)对重组蛋白进行了体外酶活的检测,结果表明,重组目的蛋白具有F3H酶活性,可将反应底物柚皮素(N)和圣草酚(E)分别转化为二氢山奈素(DHK)和二氢槲皮素(DHQ);当E作为底物时,酶活性明显高于柚皮素。本研究结果为茶树F3H酶动力学研究和其器官组织特异性研究提供了基础资料。     

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。     

枯草杆菌YLNF基因编码蛋白产物性质的研究

将枯草杆菌ylnF基因经PCR扩增,酶切后插入表达质粒pET15b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,金属螯合亲和层析一步纯化,酶活性测定。结果表明:ylnF基因编码产物是依赖于NAD 的前咕啉-2氧化酶,一个西罗血红素生物合成末端的酶。SDS-PAGE显示YlnF亚基分子量约22kD,全酶分子量约25kD,显示酶为单体酶。将Asp102定点突变Ala102,酶活丧失,表明Asp102在催化中起重要作用。     

茶多糖的提取与初步纯化

本试验采用水煮醇沉淀法研究了影响茶叶多糖(TPS)提取的因素,并利用苯酚-硫酸法测定多糖含量.通过控制和改变提取时间、提取温度、乙醇沉淀体积倍数研究这些因素对提取结果的影响,并比较了Sevag法与三氯乙酸(TCA)法除蛋白质的效果,再利用凝胶柱层析法时TPS进行初步纯化.结果表明.TPS最佳提取的条件为100℃、4 h、2.5倍体积乙醇沉淀效果最佳.粗糖提取率为9.1624%,相对含量为44.6%.TCA法除蛋白质效果较好,经凝胶柱层析,确定本方法所提取的茶叶多糖为一种糖蛋白.     

茧层量差异家蚕品种后部丝腺细胞和血液组织的蛋白质表达谱分析

为了研究家蚕茧层量性状的分子调控机制,采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,分析了遗传背景基本相同,而结茧性状和茧层量具有明显差异的正常茧、薄皮茧、裸蛹3个家蚕品种的丝腺细胞和血液组织的蛋白质表达与茧层量的关系。结果表明:裸蛹品种的丝腺细胞蛋白斑点与正常茧品种的蛋白斑点的匹配率仅在65%左右,且存在35%左右的特异蛋白斑点,暗示裸蛹性状可能是主效基因控制的微效多基因遗传;3个品种后部丝腺细胞特异蛋白斑点、匹配蛋白斑点按等电点划分的分布规律具有明显差异,而血液组织相应的分布规律非常相似,暗示丝腺细胞中的蛋白及其基因对家蚕茧层量性状的作用要大于血液组织中的蛋白及其基因;正常茧、薄皮茧和裸蛹3个品种后部丝腺细胞中特异蛋白斑点及上调和下调蛋白斑点中,可能分别存在着与家蚕高茧层量性状、结薄皮茧性状以及不结茧性状有关的蛋白质。     

鹅黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是其黑素皮质素受体MCR（MC1-5R）家族成员之一,属G蛋白偶联受体。它可与瘦蛋白、神经肽、α-黑素细胞刺激素等一起调节动物体重和采食量。参考鸡MC4R基因序列设计引物,克隆并测序了鹅MC4R基因。结果表明,鹅MC4R基因编码区全长996 bp,其核苷酸序列与鸡的同源性为95.3%,与人、牛、猪等哺乳动物同源性在75%-79%;其氨基酸序列与鸡的同源性达到98.5%。构建哺乳类、鸟类和鱼类MC4R基因核苷酸进化树显示,鹅较早地与哺乳类动物分化开来。分析MC4R蛋白的氨基酸残基特性参数表明,MC4R的7次跨膜结构与MC4R的亲水性区域、电荷密度以及氨基酸残基位于表面概率的变化规律相一致。     

一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能

通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法，从极细链格孢菌JH505菌株中分离纯化到分子量约为35kD的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为4．22。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子8h，7d后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高65．27％，经蛋白处理的小麦根长比对照提高13．1％。     

4株芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

从水产饲料中分离得到4株菌株,分别命名为A2、A3、A4、A5。通过16S r DNA基因序列分析,结合电镜结构观察、生长特征分析、产酶试验以及抑菌试验发现,菌株细胞形态为杆状,革兰氏染色呈阳性;A2、A4、A5菌株最适生长温度为45℃,A3菌株最适生长温度为50℃;4个菌株均产蛋白酶,A2菌株产蛋白酶能力最强;A2、A3菌株产淀粉酶,A4、A5菌株基本不产淀粉酶;4株菌株对大肠杆菌都没有抑菌作用,A2和A5菌株对共培养的沙门氏菌分别有31.2%和22.9%的抑菌效果。序列分析表明,A2菌株属于嗜热枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),A3、A4、A5菌株属于嗜热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过对4株芽孢杆菌进行初步分析研究,可为后续试验以及微生态饲料添加剂的开发及应用奠定基础。     

昆虫肠道细菌的功能和研究方法

昆虫肠道中存在大量的细菌,这些细菌具有种群结构和功能多样性的特点。目前的观点认为昆虫的种类和取食特性是造成这一现象的主要原因。昆虫的生长发育离不开这些微生物。早期的实验中只能利用传统平板培养方法通过观察菌落的生长形态和菌株的生理特性进行研究。但由于自然界中99%的微生物是无法培养的,同时培养法容易受到外界因素的干扰导致实验结果不准确,因而培养法无法满足研究人员对昆虫肠道细菌的深入研究。随着宏基因组学的兴起和分子生物学技术的发展,用新的技术研究昆虫肠道微生物成了当前的研究热点。为此,对昆虫肠道微生物的一些基本概念、主要功能和主要研究手段进行归纳整理。     

bar基因对盆栽小麦根际微生物的影响

在盆栽实验条件下,以转bar基因小麦87158(BG87)、98005(BG98)和对照小麦扬麦87158(YM87)、安农98005(AN98)为材料,对小麦各生育期的根际微生物进行分析,研究bar基因对小麦根际微生物的影响.结果表明,小麦根际微生物的数量随生育期发生变化,苗期到拔节期,小麦根际微生物数量较少;在孕穗期至抽穗期,根际微生物数量增多;抽穗期后到灌浆期,小麦根际微生物数量开始下降.转bar基因小麦和对照小麦根际细菌和真菌的数量自孕穗期开始差异极显著,而放线菌的数量差异不明显.转bar基因小麦根际细菌和真菌的主要类群与对照小麦基本相同.