菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证

从杭白菊(Chrysanthemum morifolium‘Hangbaiju’)中克隆了4个细胞壁松弛和伸展相关的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因,分别命名为CmXTH1、CmXTH2、CmXTH3和CmXTH4,序列分析表明其编码的氨基酸序列N端都含有23~30个氨基酸组成的信号肽区域和保守的催化活性位点DE(I/L)DEFLG以及紧邻的N(R/A)T组成的N端糖基化位点,CmXTH1/2/3的C端均含有4个保守的半胱氨酸残基,CmXTH1/2/3/4蛋白的相似度为66.2%。系统进化分析结果表明,CmXTH1/2/3属于XTH家族Ⅰ组,CmXTH4属于Ⅱ组。实时荧光定量结果表明:(1)菊花CmXTH1/2/3/4在根、茎、叶和花蕾中均有表达。CmXTH1在根中表达量较高,CmXTH2/3在茎中表达量较高,CmXTH4在花蕾中表达量最高。(2)CmXTH1/2/3/4在花序不同部位表达量有差异,CmXTH1/4在舌状花中表达量最高,CmXTH2/3在筒状花中表达量较高。(3)CmXTH1/2/3/4在舌状花不同发育阶段表达量差异显著,CmXTH1/2在盛花期表达量最高,CmXTH3在衰老期表达量最高,CmXTH4在初开期表达量最高。病毒诱导基因沉默结果表明,CmXTH1/2/3/4沉默系的花序直径和舌状花长度与对照相比均有所减小,其中CmXTH4沉默系减小最大,分别减小了25.67%和10.42%,舌状花花瓣表皮细胞与对照相比明显变小,影响了舌状花花瓣的伸长;CmXTH2沉默系的筒状花雄蕊长度和CmXTH4沉默系的花萼直径分别与对照相比显著减小。这表明菊花CmXTH1/2/3/4基因参与了花序的开放,促进了舌状花花瓣的伸长,对于菊花的花序增大具有重要作用。     

ABA、H_2O_2与NO供体硝普钠对基因表达以及枣果发育的影响

枣在成熟期间遇到连阴雨天气会发生严重的裂果现象,这种基于基因表达的生理病害的发生与非生物或生物胁迫有关。以吕梁当地木枣为试材,在木枣成熟期,采用改良CTAB法检测组织中DNA纯度及含量的变化,研究ABA、H2O2与NO供体硝普钠(SNP)在枣果发育中对基因表达的影响。结果表明:ABA、H2O2与NO供体硝普纳(SNP)对枣果发育中DNA纯度及含量的影响不一,差异较为明显。其中不同浓度的ABA处理枣果组织中DNA的OD260/OD280比值基本不在1.700~1.900范围内,DNA纯度差异明显。但样品DNA含量较高,其值在1 200ng/μL左右;H2O2和SNP处理样品DNA的OD260/OD280比值基本上在1.700~1.900之间,DNA纯度较高。样品DNA含量基本上小于或在1 000ng/μL左右。外源ABA较为明显地干扰了基因表达,诱导了新蛋白质、RNA和酚类物质等的生物合成,有促进木枣果发育的趋势;而H2O2和NO供体硝普钠(SNP)对基因表达或枣果发育的影响不十分明显。     

欧洲葡萄中CIPK基因的克隆及表达分析

以欧洲葡萄‘佳丽酿’(Carinena)为材料,利用RT-PCR方法获得两个CIPK基因的全长cDNA序列,分别为VvCIPK13和VvCIPK14。VvCIPK13全长为1 501 bp,包括一个1 395 bp的ORF,编码465个氨基酸;VvCIPK14全长为1 616 bp,包括一个1 404 bp的ORF,编码468个氨基酸。生物信息学分析表明两个蛋白均含有两个保守结构域:丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域,两个结构域之间有连接域,但VvCIPK13和VvCIPK14的同源性较低,仅有40.33%。利用荧光定量PCR技术研究VvCIPK13和VvCIPK14在葡萄不同组织、植物生长调节剂诱导和逆境胁迫下的表达模式,结果表明:VvCIPK13和VvCIPK14表达具有组织特异性,均在卷须中高表达;VvCIPK13对6-BA诱导有响应,而VvCIPK14对6-BA、ABA、IAA、SA、MeJA和GA_3等诱导均有不同程度的响应;VvCIPK13和VvCIPK14均响应高盐和干旱,但不响应低温,其中VvCIPK14的响应最为强烈。推测VvCIPK13和VvCIPK14在葡萄的非生物胁迫过程中发挥重要的作用。     

Bt抗虫棉新品系毒蛋白表达差异分析

【目的】本研究旨在探讨部分抗虫棉不抗虫的原因。【方法】通过室内生物测定、卡那霉素、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条、PCR分析、Southern blot检测和Bt蛋白含量检测等方法分析了23个抗虫棉新品系的抗虫性。【结果】生测结果表明供试品系间幼虫死亡率差异显著。卡那霉素、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条、PCR分析和Southern blot检测结果表明,Bt基因在供试材料中整合并稳定遗传且为单拷贝。RT-PCR结果表明,各试验品系Bt基因相对表达量差异较大,花期叶片Bt基因的相对表达量最高;Bt蛋白检测结果发现抗虫棉Bt蛋白表达量在生育前期大于后期,营养器官中的大于生殖器官,不同年份Bt蛋白含量差异显著。幼虫死亡率与Bt基因相对表达量的相关系数仅为0.1745,与Bt蛋白的相关系数为0.7130,表明Bt蛋白含量越高,抗虫性越好;各组织器官的Bt蛋白与Bt基因的相对表达量相关系数为-0.3659~0.2542,二者表达趋势不一致,表明遗传背景对抗虫棉Bt蛋白的表达具有一定影响。且Bt基因可能在转录后受到调控导致Bt蛋白含量发生变化,从而影响了抗虫棉的抗虫性。【结论】这些结果有望为抗虫棉育种提供参考。     

月季bHLH基因的克隆、表达及其与MYB和WD40的互作分析

以月季‘月月红’(Rosa chinensis‘Slater’s Crimson China’)花瓣为材料,利用同源克隆法鉴定到1个Rcb HLH基因的c DNA全长序列,并研究了其生物信息学特征、组织特异性表达及其与MYB和WD40的互作关系。序列分析表明,Rcb HLH的开放阅读框长2 112 bp,编码703个氨基酸,基因登录号为KY783912。结构域序列分析显示,Rcb HLH为一个保守的N端含有碱性氨基酸的DNA结合区、C端含有α螺旋–环–α螺旋的b HLH蛋白。对Rcb HLH进行系统进化分析发现,Rcb HLH与草莓及其他蔷薇科植物的b HLH蛋白具有较高的同源性。组织特异性实时定量RT-PCR分析揭示Rcb HLH基因主要在花瓣中表达。酵母双杂交结果显示,Rcb HLH能与Pav MYB和Pav WD40相互作用形成MYB-b HLH-WD40复合物。以上结果为进一步研究Rcb HLH的功能鉴定奠定了基础。     

青花菜锌指蛋白基因BoCCCH1的克隆和表达分析

CCCH锌指蛋白广泛存在于真核生物中,在植物的生长、发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。为获知青花菜CCCH转录因子基因的序列特征和表达特性,从青花菜叶片中克隆到1个CCCH基因,命名为Bo CCCH1,同时,利用RT-PCR方法研究了其在不同器官及霜霉菌侵染叶片中的表达模式。序列分析结果表明,Bo CCCH1的基因组全长为1 568 bp,包含1个长度为599 bp的内含子,2个长度分别为627 bp、342 bp的外显子,编码322个氨基酸,蛋白质的分子量与等电点分别为35 296.42 Da和8.47;Bo CCCH1有2个锌指结构,类型均为C-X8-C-X5-C-X3-H。系统发育分析结果表明,Bo CCCH1与其它植物的21条同源序列在进化树上分为6组,来自十字花科的CCCH与Bo CCCH1处于同一分支。基因表达结果表明,Bo CCCH1在叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中表达,其中花茎和嫩角果的表达量最高,但在根中未检测到表达;在霜霉菌侵染下,叶片Bo CCCH1的表达量升高,到24 h和36 h时达到最大,推测Bo CCCH1与霜霉病抗性相关。本研究为进一步探明Bo CCCH1在霜霉病抗性反应中的功能奠定了基础。     

m6A甲基化在鸡肌肉生长发育中的表达研究

试验旨在研究RNA m6A修饰相关基因去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5，ALKBH5）、去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP）在鸡骨骼肌发育过程中的表达，分析其与骨骼肌m6A甲基化水平的相关性。首先，利用实时荧光定量PCR技术检测m6A甲基化相关基因在金茅花鸡12（E12）、14（E14）、16（E16）、18（E18）胚龄和1日龄腿肌和胸肌组织中mRNA表达水平，以及其在鸡成肌细胞50%、100%增殖期和1、2、3、4、5 d分化期的mRNA表达水平；随后，利用m6A甲基化试剂盒检测金茅花鸡E12和1日龄腿肌和胸肌组织中m6A甲基化修饰水平，与m6A甲基化相关基因表达水平进行相关性分析。结果显示，m6A去甲基化基因ALKBH5和FTO mRNA表达水平在骨骼肌发育过程中显著上调（P<0.05），即在E12、E14低表达，E16、E18逐渐上调，1日龄达到最高。m6A甲基化写入基因METTL14、METTL3和WTAP mRNA表达水平在E12、E14、E16逐渐上升，E18下降，随后至1日龄表达量回升。在细胞增殖过程中，ALKBH5、FTO、METTL14、METTL3和WTAP基因表达均上调；在细胞分化过程中ALKBH5和FTO基因表达水平显著上调（P<0.05），在分化第5天达到最高。METTL14、METTL3和WTAP基因mRNA表达水平在细胞诱导分化的1、2、3、4 d表达量呈下降趋势，而在诱导分化的第5天有所回升。甲基化水平检测结果显示，腿肌和胸肌m6A甲基化水平变化趋势一致，均在胚胎发育过程中显著下降（P<0.05），至1日龄达到最低。相关性分析结果显示，鸡骨骼肌RNA m6A甲基化水平与m6A去甲基化修饰基因ALKBH5、FTO mRNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。综合以上试验结果，推测m6A甲基化修饰与鸡骨骼肌发育相关，而去甲基化基因ALKBH5、FTO可能通过调控RNA m6A甲基化水平，影响鸡骨骼肌发育。本研究结果为进一步研究m6A甲基化修饰调控鸡骨骼肌生长发育的功能和分子机制提供理论依据。     

牦牛WDR43基因的克隆、表达和功能分析

WDR43(WD Repeat Domain 43)是一种核糖体生成因子。本研究旨在分析牦牛WDR43序列的结构功能及其在牦牛组织和早期胚胎不同阶段的表达情况，从而为研究WDR43在牦牛早期胚胎发育过程中的作用机制提供实验依据。本实验选取30～90 d胚龄左右的牦牛胎儿（n=2）和3～4岁健康的母牦牛（n=2）作为材料，克隆获得牦牛WDR43的编码区，生物信息学分析预测WDR43功能并通过qRT-PCR获得WDR43在牦牛不同组织的表达情况。结果表明，牦牛WDR43编码区长度为2 046 bp，编码681个氨基酸，该序列有45.23%可能形成无规则卷曲，29.37%形成α螺旋，20.41%形成延伸链，4.99%形成β-转角。WDR43总体带正电荷，属于不稳定蛋白，无跨膜结构及信号肽。WDR43氨基酸序列高度保守，与牛、山羊、绵羊和野猪WDR43基因同源性较高，分别为98.85%、98.53%、98.09%和93.83%。WDR43在卵巢的表达量显著高于其他组织，并且在早期胚胎过程中均有表达，说明WDR43可能参与了牦牛的早期胚胎发育。本研究成功获得了牦牛WDR43基因编码区序列，分析其...     

phyA、phyB基因沉默对不同秋眠型苜蓿光受体基因表达量的影响

苜蓿秋眠性是苜蓿一种生长特性，是苜蓿应对环境变化的一种特殊休眠方式，和日照长度及光周期敏感度有关。本试验研究沉默光敏色素A、B基因对苜蓿光受体基因表达的影响，检测phyA、phyB基因沉默对不同秋眠型紫花苜蓿光受体基因phyA、phyB、CRY2B、FHY1表达的影响。结果表明：秋眠型紫花苜蓿phyA沉默的转基因植株T1、T2代phyA、FHY1的表达量下降（P <0.05）,phyB、CRY2B的表达量上升（P <0.05）；非秋眠型紫花苜蓿phyA沉默的转基因植株T1代phyA、FHY1的表达量差异不显著（P> 0.05），但phyB、CRY2B的表达量显著增加（P<0.05）；非秋眠型紫花苜蓿phyB沉默的转基因植株T1代phyA、FHY1的表达量显著增加（P <0.05），但phyB、CRY2B的表达量差异不显著（P> 0.05）。在光信号转导途径，phyA、FHY1基因表达趋同，phyB与蓝光受体CRY2B基因表达趋同，沉默光敏色素A、B对几个光受体基因表达量均产生影响，phyA、phyB、FHY1、CRY2B之间可能存在互作效应。     

‘月月粉’月季PP2C家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

利用生物信息方法从月季‘月月粉’(Rosa chinensis ‘Old Blush’)基因组中共鉴定出69个PP2C家族成员,其编码氨基酸的长度在122～1 082 aa之间,等电点介于4.03～9.34,大部分蛋白呈亲水性。系统进化树分析将其分为12个亚族,同一亚族内基因结构和保守基序具有较高的相似性。基因片段复制事件是PP2C家族基因扩张的主要原因。启动子顺式作用元件分析表明约85%的月季PP2C含有逆境应答元件、激素应答元件等,推测其在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。月季PP2C基因的表达具有组织和发育时期特异性,且部分基因参与干旱和高温胁迫响应过程,其中3个A亚族基因在干旱胁迫中响应明显,1个A亚族基因和2个G亚族基因在高温胁迫中响应明显。通过qRT-PCR分析11个不同亚族PP2C基因在月季失水胁迫和ABA处理下的表达模式,发现6个A亚族基因(RC0G0099200、RC1G0458700、RC1G0569200、RC2G0066800、RC2G0089100和RC5G0571100)和1个G亚族基因(RC3G0083700)的表达量显著升高,表明这些基因可能受ABA诱导...