花生AhMAPK14基因的克隆及表达分析研究

环境胁迫严重影响花生的产量和品质.筛选并研究花生中胁迫响应相关基因,对深入解析花生响应胁迫的分子机理具有重要意义.本研究从花生果腐病转录组文库中筛选并克隆得到花生基因AhMAPK14,对其进行了生物信息学分析及亚细胞定位,并利用qRT-PCR技术分析了其组织表达特异性及在不同处理下的表达模式.结果表明,AhMAPK14...     

油棕Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶EgSAD基因的克隆及表达分析

^Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶（^Δ9 stearoyl-ACP dehydrogenase,SAD）是植物中重要的脂肪酸脱氢酶,在调控不饱和脂肪酸合成中发挥着重要作用。本研究以非洲油棕和杂交油棕为材料,在油棕果实油脂积累期,分别测定花后120、140、160 d 3个时期的脂肪酸组分;从油棕中克隆SAD基因,并对其理化性质、进化关系、启动子顺式作用元件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测SAD在2个油棕品种果实成熟期的表达特征。结果表明：非洲油棕中总不饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）比例（55.76%~60.27%）显著高于杂交油棕（37.2%~45.43%）,杂交油棕中不饱和脂肪酸（油酸和亚油酸）比例（51.61%~56.92%）显著高于非洲油棕（35.54%~38.64%）;鉴定了7个基因命名为：EgSAD1~EgSAD4和OeSAD1~OeSAD3;EgSAD基因编码的肽链平均为413个氨基酸,分子量为43.41~45.92 kDa,等电点为5.99~7.13,蛋白不稳定指数为44.07~53.25,总平均亲水性为-0.496~-0.405。OeSAD基因编码的肽链平均为405个氨基酸,分子量为44.94~49.39 kDa,等电点为6.05~7.14,蛋白不稳定指数为43.44~44.61,总平均亲水性为-0.554~-0.489。多序列比对分析,油棕SAD基因氨基酸序列中存在典型SAD特征的保守组氨酸富集区：EENRHG和DEKRHE。在SAD的启动子上鉴定出植物激素响应、逆境胁迫响应、光响应和逆境响应顺式作用元件。EgSADs在油棕果实成熟过程中呈上调表达趋势,EgSAD1和EgSAD2在杂交油棕中表达量显著高于非洲油棕,OeSADs在杂交油棕果实花后140 d中表达量最高,在杂交油棕的3个时期中均呈现先升高后下降的趋势,且在花后120 d的表达量显著高于花后120 d和160 d。本研究结果为进一步研究SAD调控油棕不饱和脂肪酸合成的机制奠定基础。     

油棕甾醇合成关键酶基因DWF5的克隆及表达分析

DWARF5（DWF5）基因,编码7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterol reductase）,是甾醇合成的关键酶,通过调控甾醇的合成参与植物油体（oil bodies,OBS）的形成。为了探究DWF5基因对油棕果肉中油体发育的影响,以‘热油4号’为材料,提取油棕果肉的RNA,以反转录的cDNA为模板进行基因的全长克隆,获得2个EgDWF5基因并分别命名为EgDWF5-1和EgDWF5-2。运用生物信息学的方法对其理化性质、结构特点和亲缘关系等进行分析预测,利用实时荧光定量PCR对其在油棕的根、茎、叶、花及花后不同时期的果实进行表达水平分析。结果表明：EgDWF5-1和EgDWF5-2基因编码的氨基酸数量分别为434个和374个,相对分子质量为49.71 kDa和42.68 kDa,等电点为8.61和8.69,其蛋白不稳定指数为38.60和38.13,脂肪族指数为98.80和96.68,总平均亲水性为0.347和0.313,均具有疏水性。EgDWF5与水稻和玉米亲缘关系最近,与其他物种关系较远。qRT-PCR分析表明,EgDWF5基因在油棕的各个器官均有表达,其中EgDWF5-1基因在果肉中高表达,显著高于根、叶、花等部位,其表达趋势为花后12~18周升高,至20周时达到最高后表达量逐渐降低,这与油棕果肉中油体的发育趋势基本一致。EgDWF5-2基因在根和茎中高表达而在果肉中表达量低,其果肉中表达趋势为花后12~18周逐渐降低。因此,推测EgDWF5-1参与调控油棕的油体发育,EgDWF5-2未参与该调控而可能在油棕的生长发育中发挥功能。本研究为进一步探索EgDWF5基因调控油棕中油体的形成机制奠定基础。     

玉米ZmGAPDH2基因的克隆及表达特性分析

研究通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR和同源克隆技术从玉米叶片中克隆出GAPDH2基因的全长cDNA序列。采用qRT-PCR分析两个玉米品种登海605和蠡玉35幼苗叶片中GAPDH2基因在非生物胁迫和ABA 处理下的表达特性,利用二维凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI-TOF）,对登海605和蠡玉35幼苗在干旱胁迫下叶片中的GAPDH蛋白表达水平进行分析。结果表明,ZmGAPDH2基因开放阅读框（ORF）全长1 014 bp,编码337个氨基酸。ZmGAPDH2蛋白分子量为36.53 kDa,属于亲水性蛋白。生物信息分析发现,玉米 ZmGAPDH2 蛋白和单子叶植物小米 GAPDH2 蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94.66%。qRT-PCR分析表明,ZmGAPDH2在登海605和蠡玉35叶片中均能被ABA和PEG处理诱导表达,登海605在NaCl和蠡玉35幼苗在低温处理下其表达量均有所下降。干旱对登海605和蠡玉35幼苗叶片中ZmGAPDH2蛋白表达量也有影响。     

Expression activity of the CpTI gene in transgenic rice plants

Ｐｌａｎｔｈａｒｂｏｕｒｅｄｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｓａｐａｒｔｏｆｔｈｅｎａｔｕｒａｌｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｓｙｓ ｔｅｍａｇａｉｎｓｔｉｎｓｅｃｔｐｒｅｄａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｆｏｒｅｉｇｎ ｐｌａｎｔ ｐｒｏ ｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｇｅｎｅｓｃａｎｅｎｈａｎｃｅｒｅ ｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｉｎｓｅｃｔｐｅｓｔｓ．Ｓｏｆａｒ，ａｔｌｅａｓｔ２０ｋｉｎｄｓｏｆｐｌａｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｏｂａｃｃｏ，ｒｉｃｅ，ｔｏｍａｔｏ，ｃｏｔｔｏｎｅｔａ…     

花青素代谢对陆地棉叶片和纤维色泽呈现的影响

【目的】棉花作为一种重要的经济作物和油料作物,其叶片和纤维均可积累色素物质,呈现不同颜色。叶绿素、类胡萝卜素和花青素的含量及其比例是棉花叶片呈色的主要原因,而棕色纤维中主要色素成分为花青素单体氧化聚合而成的原花青素及其衍生物。通过分析陆地棉不同的叶色突变体叶片和纤维中的花青素含量,花青素和原花青素合成途径中关键基因的表达,探究棉花叶片和纤维颜色呈现与花青素合成的关系,为叶色突变体的利用和彩色棉纤维色泽的改良奠定基础。【方法】通过测定21个陆地棉叶色突变体的叶片花青素含量,根据叶色突变体叶片、纤维颜色和花青素含量差异,筛选了其中6个典型的棉花叶色突变体作为研究材料,比较叶片和纤维（开花后15 d）中的花青素含量,分析花青素含量与叶片、纤维颜色呈现的关系;同时检测叶片及不同发育时期纤维（开花后5、10、15和20 d）中花青素合成关键基因GhCHS和原花青素合成途径关键基因GhLAR和GhANR的表达水平,分析目标基因对叶片和纤维颜色呈现的影响。【结果】21个陆地棉叶色突变体叶片中的花青素含量差异显著,呈现紫红色或紫色的叶片花青素含量高。在筛选的6个陆地棉叶色突变体及其对照叶片和不同发育时期纤维中,叶片花青素含量显著高于纤维,棕色纤维的花青素含量显著高于白色纤维。叶片中,GhCHS表达量较高,而GhANR和GhLAR表达量较低,花青素积累与颜色呈现与其表达量没有显著的相关性;而在纤维中,GhANR和GhLAR在棕色纤维的表达量极显著高于白色纤维中,且主要集中在纤维发育的5—15 DPA高表达。【结论】陆地棉叶片和纤维的颜色呈现均与花青素含量有关,紫色及紫红色叶片以及棕色纤维中花青素含量高,但纤维颜色的形成与棉花叶片颜色呈现没有显著的相关性,其花青素含量与原花青素合成途径的关键基因GhANR和GhLAR表达水平直接相关,表明棉花叶片和纤维中的呈色机制不一致,原花青素主要在纤维中积累显色。     

荔枝果皮BPox的分离纯化及其在果实成熟过程中的表达

【目的】植物第III类过氧化物酶具有广泛的生理功能。前期研究发现荔枝果皮具高活性的离子结合态过氧化物酶（BPox）,与果实的着色、成熟密切关联,但其特性、作用机制不清楚。明确BPox的生化特性及其基因表达变化,为进一步研究BPox参与荔枝果实着色和成熟机制奠定基础。【方法】以‘乌叶’荔枝成熟果果皮为材料,通过提取及Streamline Phenyl、CM-52、Phenyl Sepharose HP和Superdex 200等柱层析,纯化获得BPox。测定BPox的最适反应pH、最适反应温度、底物特异性、抑制剂等生化特性。采用双倒数法测定其催化愈创木酚、(-)-表儿茶素的K_m值及V_max。应用MALDI串联质谱鉴定BPox的肽段序列,克隆BPox的cDNA。分别测定盛花后58、69、76、80和90 d荔枝果皮BPox的活性变化,应用荧光定量PCR分析BPox的基因表达变化。【结果】从荔枝果皮纯化得到BPox最主要的2个组分,分别命名为BPox-2和BPox-3。凝胶过滤层析和SDS-PAGE结果显示,BPox-2和BPox-3的表观分子量分别约为30 kD和34 kD。BPox-2和BPox-3的最适反应pH均为6.0,最适反应温度分别为40℃和45℃;二者具有相似的底物特异性;DTT、ASA和L-Cys等能强烈抑制其活性。BPox-2和BPox-3催化愈创木酚的K_m值分别为2.97和2.58 mmol∙L^-1,其V_max分别为38.72×10⁶和23.06×10⁶ U∙mg^-1;其催化(-)-表儿茶素的K_m值分别为3.49和3.24 mmol∙L^-1,V_max分别为38.72×10⁶和23.06×10⁶ U∙mg^-1。尽管BPox-2和BPox-3的肽质量指纹（PMF）不同,串联质谱分析显示,二者均具一个序列为TASLSAANSDLPSPFADLATLIAR的胰酶水解肽段。克隆得到BPox2的cDNA,大小为960 bp,共编码319个氨基酸。cDNA编码的多肽链N端包含1段26个氨基酸残基的信号肽,C端缺乏液泡分选序列,具1个潜在的N-糖基化修饰位点。幼果期,荔枝果皮BPox的活性表现弱;至盛花后76 d,果皮开始着色变红,BPox的活性迅速启动升高直至果实成熟。qPCR的结果显示,在盛花后的58和69 d,果皮BPox2的转录水平很低;盛花后76 d,BPox2的表达急剧上升,达到高峰,为盛花后69 d的60.56倍,而后下降。至盛花后90 d,其表达水平又显著上升。【结论】荔枝果皮的BPox-2与BPox-3最适反应pH、最适反应温度、底物特异性等与荔枝果皮可溶性Pox组分相似,但其对愈创木酚和(-)-表儿茶素的催化效率显著高于SPox。BPox-2与BPox-3同为BPox2所编码,因翻译后修饰差异而形成同工酶。BPox参与荔枝果皮的着色和成熟进程,其活性受转录水平调控。     

苦荞WOX家族全基因组鉴定及响应愈伤诱导率表达分析

【目的】全基因组鉴定苦荞WOX（WUSCHEL-related homeobox）基因,揭示其基因家族成员序列特征、基因表达模式及与出愈率的相关性,为突破苦荞再生及遗传转化难题提供理论基础。【方法】基于同源性搜索策略,以拟南芥WOX基因蛋白为参考序列,进行苦荞全基因组比对,获得苦荞WOX基因家族成员蛋白及核酸序列。基于蛋白同源性及保守结构域分析,鉴定出苦荞WOX基因家族所有成员。同时使用TBtools软件展示FtWOXs家族成员基因结构、保守结构域及启动子顺式作用元件特征。比较分析WOX基因家族成员在苦荞与拟南芥之间的基因组共线性。基于邻近法,利用MEGA X软件构建苦荞、拟南芥和水稻WOX基因家族成员蛋白序列系统进化树。以MS+2,4-D 3.0 mg·L^-1+6-BA 1.0 mg·L^-1为愈伤诱导培养基,下胚轴为外植体,选取70份苦荞品种诱导愈伤组织,评价不同基因型的出愈率。qRT-PCR比较分析高、低出愈率苦荞品种间FtWOXs基因表达水平。基于Pearson相关系数分析出愈率与FtWOXs基因家族成员表达相关性。【结果】共鉴定出30个苦荞WOX基因成员,在苦荞8条染色体上呈现不均匀分布。系统进化树表明30个苦荞WOX基因可划分为3大类,不同类群中WOX基因包含不同的保守结构域,主要的保守结构域为HD（Homeodomain）、START和MEKHLA结构域。保守基序分析表明,FtWOXs基因家族成员所含保守基序数目的范围为2—10个。基因结构分析表明,FtWOXs基因家族成员所含外显子数目的范围为2—18个。顺式作用元件分析表明FtWOXs基因启动子富含26个不同种类的顺式作用元件。系统进化分析表明,30个苦荞、15个拟南芥和12个水稻WOX基因家族成员可分为3类,其中第3类为苦荞独有。基因组共线性分析表明,6个WOX基因在苦荞和拟南芥之间存在基因组共线性。表达模式及相关性表明,FtWOX1/FtWOX12/FtWOX22/FtWOX23/FtWOX24与苦荞出愈率存在正相关性。【结论】苦荞FtWOXs成员存在丰富的序列变异特征,不同苦荞基因型中WOX基因表达水平及出愈率存在明显差异和一定的相关性,揭示不同苦荞WOX基因具有潜在的功能多样性。     

樱桃谷鸭种公鸭睾丸发育和生殖轴基因表达

为了揭示樱桃谷鸭种公鸭的睾丸发育规律,本研究以75日龄、105日龄、135日龄和165日龄樱桃谷鸭种公鸭为研究对象,首先通过组织学方法观察睾丸发育和精子发生情况,其次通过Q-PCR方法检测下丘脑-脑垂体-睾丸轴组织中相关基因表达情况.结果发现,与105日龄相比,135日龄时睾丸质量增加了10倍以上,曲精细管直径和上皮生精细胞数量增加,脑垂体FSHβ基因mRNA表达量增加了40倍以上.与75日龄相比,105～165日龄脑垂体组织中GnIHR基因mRNA表达量显著降低.随着日龄增加,樱桃谷鸭种公鸭睾丸支持细胞特异性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因和间质细胞特异性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表达量显著增加.以上结果表明,自135日龄开始,在脑垂体FSH和LH刺激下,樱桃谷鸭种公鸭睾丸进入快速发育阶段,支持细胞和间质细胞的分泌功能增强;165日龄时,睾丸能够产生成熟精子,表明睾丸发育达到性成熟阶段.本研究结果为后续樱桃谷鸭种鸭的繁殖研究提供基础资料.