海蜇Frizzled1基因的克隆及在无性繁殖中的表达

采用RACE技术解析了海蜇(Rhopilema esculentum)Frizzled1基因的cDNA和基因组结构:Re-Fzd1基因的全长cDNA为2387 bp,其中编码区为1761bp,编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Fzd1基因具备Fzd家族共同的结构特征,包括:一个由23个氨基酸组成的信号肽,一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD),一个含有7个跨膜片段的跨膜结构域,以及一个含有5个重要的磷酸化位点的C端尾巴。多序列比对表明,Re-Fzd1基因与刺胞动物贝螅(Hydra echinata)、水螅(Hydra vulgaris)、半球美螅水母(Clytia hemisphaerica)和海葵(Nematostella vectensis)Fzd1具有高度相似性,与来自脊椎动物人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)的Fzd1、Fzd2和Fzd7家族基因也具有较高的同源性。基于N-J法,将人、鼠、爪蟾、斑马鱼和果蝇(Drosophila melanogaster)所有Fzd家族基因系统进化分析显示,除果蝇外,所有Fzd家族成员聚类成4个类群,11个亚家族,海蜇Re-Fzd1基因首先与刺胞动物门的Fzd1聚类在一起,然后与脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7三个家族聚成一个类群,表明脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7家族可能与刺胞动物门的Fzd1起源于同一个共同祖先。Re-Fzd1基因组序列中不含有内含子。实时荧光定量PCR结果显示,Re-Fzd1基因在海蜇无性繁殖的4个发育阶段均有表达,其中,表达量最高的横裂体阶段是表达量最低的稚水母阶段的3.67倍。整体原位杂交显示,在海蜇横裂体时期,Re-Fzd1原位表达在触手、基座及发生横裂的部位。这些结果都表明,Re-Fzd1不但参与了海蜇的早期发育过程,还调控了海蜇无性繁殖的发生。     

水稻种子特异表达基因OsEnS38的克隆与表达

以粳稻中花11为材料,利用生物信息学技术,结合RT–PCR,克隆了水稻OsEnS38的c DNA序列;其编码的蛋白序列包含2个Cupin_1保守结构域,属于典型的Bicupin亚家族。启动子分析发现,OsEnS38启动子区域含有多种与胚乳特异表达相关的顺式作用元件;q RT–PCR和原位杂交结果证实,OsEnS38在开花后7~14 d的种子中特异表达,在第10天的胚乳中表达量最高,达29.73;杂交信号在第7、10天的胚乳中高表达;共表达分析显示,共表达基因参与水稻胚后发育和生殖发育调控,表明该基因在种子发育和储藏物质积累过程中发挥作用。     

水稻RNA原位杂交体系的优化

为了能准确、快捷地追踪目标基因在水稻中的表达,并提供在不同植物中基因表达的研究基础,优化了水稻RNA原位杂交体系。以卡诺固定液处理材料,原位杂交结果显示:细胞边界清楚,标本背景清晰,检测信号强。设置了0、15、25、35和45 min 5个消化时间梯度,消化时间是25 min的试验结果显示:杂交信号分布于整个受检表面,信号可检测性强,并在不同组织结构中信号强弱不同。以根尖为材料,杂交液A的检测信号符合分布规律,杂交液B验证反义探针检测信号较弱,杂交液C验证反义探针检测信号进一步减弱,并伴随着验证正义探针信号增强。以叶片为试验材料,杂交液A和B的原位杂交结果差异不大,而杂交液C验证反义探针信号减弱,验证正义探针信号增强。结论:水稻RNA原位杂交体系的固定液为卡诺固定液,最佳消化时间为25 min,杂交液为杂交液A。     

普通西瓜3个变种45S rDNA和5S rDNA的染色体定位

【目的】为了探明普通西瓜种(Citrullus lanatus)3个变种间的亲缘关系和进化与驯化过程,【方法】利用双色荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH),将核糖体45S rDNA和5S rDNA在11份栽培变种(Citrulluslanatus subsp.vulgaris)、2份Egusi变种(C.lanatus subsp.mucosospermus)和3份Citroides变种(C.lanatus subsp.lana-tus)有丝分裂中期染色体上进行了定位研究。11份栽培变种西瓜和2份Egusi类型西瓜都含有2对45S rDNA位点和1对5S rDNA位点,3份Citroides变种都含有1对45S rDNA位点和2对5S rDNA位点。【结果】结果表明,普通西瓜种3个变种内部各基因型间具有相同的45S rDNA和5S rDNA分布模式,栽培变种和Egusi变种具有相同的分布模式,但它们均与Citroides变种存在明显差异,说明栽培变种与Egusi变种之间的亲缘关系更近一些。【结论】rDNA序列分布分析为在分子细胞学水平开展栽培西瓜的进化与驯化分析提供了证据。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

45S和5S rDNA序列在20种葫芦科植物染色体上的定位

【目的】了解45S和5S rDNA序列在20种葫芦科Cucurbitaceae植物基因组中位点数目和分布特点,为研究葫芦科植物核型、遗传育种和进化分类等提供依据。【方法】采用改进的荧光原位杂交(FISH)法,在45S rDNA和5S rDNA的5′端进行荧光修饰,对20种葫芦科植物中期染色体进行45S和5S rDNA的物理定位,在Nikon 80i荧光显微镜下观察,冷CCD收集图像并分析。【结果】确定了金瓜Gymnopetalum chinense、波棱瓜Herpetospermum pedunculosum、葫芦Lagenaria siceraria、木鳖子Momordica cochinchinensis、云南木鳖Momordica dioica、西葫芦Cucurbita pepo、蛇瓜Trichosanthes anguina、糙点栝楼Trichosanthes dunniana、全缘栝楼Trichosanthes ovigera、钮子瓜Zehneria maysorensis、红瓜Coccinia grandis和佛手Sechium edule等12种植物45S rDNA和5S rDNA荧光位点在中期染色体上的数量、位置和特征,在这些植物中分别检测到3、7、2、4、2、5、3、3、5、1、2和2对45S rDNA,检测到2、1、1、1、1、2、1、1、1、1、1和1对5S rDNA。20种植物中,45S rDNA和5S rDNA在染色体短臂、短臂顶端和着丝点等位置均有分布。【结论】FISH是葫芦科植物构建精细核型的有效工具,可帮助判断随体、鉴别染色体和鉴定同源染色体,是核型分析的有力佐证。     

小麦-长穗偃麦草异染色体系筛选与鉴定

二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum(Host) A. Löve,2n=2x=14,EE)具有抗病性强、耐盐碱、抗旱、多花多实等优异性状。为明确引进的小麦-长穗偃麦草后代种质系的染色体遗传组成,本研究综合利用原位杂交与分子标记技术结合田间农艺性状对其进行鉴定。结果表明,16份小麦-长穗偃麦草种质系中,L20161461、L20161462两份材料是二体异附加系,分别附加6E和7E染色体;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459四份材料是二体异代换系,分别是4E/4D、4E/4D、1E/1D、3E/3B;与中国春相比,L20160947的千粒重增幅57.02%,达到极显著水平;在2.2%NaCl溶液处理下,L20160940的耐盐性高于中国春。本研究为这些材料在小麦遗传改良中的进一步利用奠定了基础。     

磷素对小麦(Triticum aestivum L.)淀粉粒微观特性的影响及其形成机理

【目的】磷是小麦生长发育必需的三大营养元素之一。小麦淀粉粒表面存在微孔和微通道结构,对淀粉的生物合成和理化特性有重要影响。探索磷素对淀粉粒微观特性的影响及其形成机理,可为研究不同磷素条件下小麦淀粉的生物合成及品质变化机理提供新途径。【方法】采用新疆冬小麦主栽品种新冬23号为参试材料,设置3种施磷水平,不施磷(CK:P_2O_5 0 kg·hm~(-2))、常规施磷(CP:P_2O_5 105 kg·hm~(-2))和高量施磷(HP:P_2O_5 210 kg·hm~(-2)),所用肥料为重过磷酸钙,于小麦播种后160 d(大约5%的植株已返青)开沟条施,并于花后7、14、21、28和35 d取样。通过扫描电镜观察不同磷素水平成熟期淀粉粒微观结构以及淀粉粒在内源(种子萌发)和外源淀粉酶(淀粉葡萄糖苷酶)酶解条件下的形态变化,同时测定淀粉粒经淀粉葡萄糖苷酶水解后产生的还原糖浓度;通过激光共焦显微镜观察淀粉粒微通道结构的变化;通过实时荧光定量PCR研究籽粒发育过程中淀粉合成酶与降解酶基因表达量,并通过原位杂交技术对淀粉降解酶关键基因进行定位。【结果】不同磷素条件下小麦胚乳淀粉粒形态未发生明显改变,但CP处理条件下更容易观察到淀粉粒的微孔结构,且其内部显示出较多荧光;另外,籽粒发芽6 d时,CP处理条件下淀粉粒表面的孔洞最多。经外源淀粉葡萄糖苷酶处理后,HP和CP处理条件下更容易观察到被水解成两半的A型淀粉粒,同时其产生的还原糖浓度也显著提高,这说明不同磷素条件下淀粉粒表面和高部微观结构发生了变化。常规施磷条件下,小麦胚乳淀粉合成与降解相关酶基因的表达量显著高于不施磷和高量施磷。施磷条件下胚乳外缘amy4、bam1和bam5转录水平提高,且常规施磷条件下转录水平更高。【结论】常规施磷条件下胚乳边缘淀粉酶基因转录水平的提高可能影响了淀粉合成酶和降解酶之间的平衡,进而影响淀粉粒的合成和微观特性变化。     

水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

根据水稻干尖线虫转录组测序结果,采用c DNA末端快速扩增技术(RACE法)从水稻干尖线虫中克隆到效应因子SPRY同源基因,并将其命名为Ab–SPRYSEC(NCBI登录号为KT188820)。该基因全长为2 089 bp,包含1个1 962 bp的开放阅读框(ORF)。预测蛋白编码653个氨基酸,相对分子质量为72 009,理论等电点为4.82,不稳定指数为41.5,属于不稳定性蛋白。保守区预测分析结果表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH 2个保守结构域,属于SPRY超家族。多序列比对分析结果表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白的相似度为43%。蛋白结构分析结果表明,β–折叠与无规则卷曲是Ab–SPRYSEC蛋白的主要结构元件。表达定位分析结果表明,Ab–SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab–SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫效应因子,在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

小麦-滨麦附加易位系DM 5911的创制及其细胞遗传学鉴定

滨麦(Leymus mollis(Trin.)Pilger,NsNsXmXm,2n=28)具有抗旱、耐寒、抗多种真菌和细菌病害、茎秆粗壮、大穗多花等特性,是麦类作物品种改良的优异种质资源。本研究采用细胞遗传学方法对由八倍体小滨麦M842-16与硬粒小麦品种D 4286杂交F6代选育出的1个附加易位系DM 5911进行了鉴定和农艺性状分析。细胞学镜检显示,DM 5911的染色体构型为2n=44=22Ⅱ;根尖体细胞原位杂交鉴定显示,DM 5911含有2条完整的Ns染色体和2条易位的Ns染色体;花粉母细胞原位杂交鉴定显示,DM 5911的2条完整Ns染色体和2条易位Ns染色体可以进行正常的联会配对和遗传。表明DM 5911是1个遗传稳定、包含1对完整的Ns染色体和1对易位Ns染色体的小滨麦附加易位系。形态学调查显示,DM 5911在株高和分蘖数等农艺性状方面得到了明显的改善。该附加易位系作为进一步创制小滨麦小片段染色体易位系的重要种质材料,可用于小麦染色体工程育种与遗传改良。