高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

MS培养基中氮、磷无机盐对鳗草克隆幼苗生存的影响

为了探究MS培养基中氮、磷无机营养盐对鳗草生长的影响。单独添加不同浓度KNO₃、NH₄NO₃和KH₂PO₄的天然海水中培养鳗草克隆苗,于7、14天进行植株形态学观察和叶片叶绿素含量测定。其中,KNO₃的添加量为MS培养基中的1/2倍、1倍和2倍及NO₃^-总浓度为39.4 mmol/L,KH₂PO₄和NH₄NO₃的添加量均为MS培养基中各自浓度的1/2、1和2倍。结果表明,叶绿素含量以KNO₃处理组最高(P<0.05),克隆苗培养14天无毒害现象,且有新叶发出;NH₄NO₃和KH₂PO₄处理组均对克隆苗有明显毒害作用,NH₄NO₃处理组叶片48 h后开始褐化,7天后茎尖、根尖明显变软并褐化,14天后植株死亡;KH₂PO₄处理组培养14天后叶片平均褐化率达56%。因此,1/2、MS培养基均不适用于鳗草的室内培养,其培养基的氮源应为单独添加的NO₃^--N或高浓度NO₃^--N+低浓度NH₄⁺-N。     

有机肥施用对红地球葡萄产量、品质及土壤环境的影响

【目的】明确有机肥施用对河北葡萄主产区高产优质红地球葡萄产量、品质及土壤环境的影响,为葡萄种植合理施用有机肥提供理论依据。【方法】以河北张家口市怀来县葡萄试验示范基地13年生红地球葡萄为试验材料,进行为期4年的田间试验。设置6个处理,分别为农民传统施肥(CK)、单施化肥(NPK)、单施有机肥9 t/hm^2 (M)、有机肥7.5 t/hm^2+化肥(M1NPK)、有机肥15 t/hm^2+化肥(M2NPK)、有机肥45 t/hm^2+化肥(M3NPK),采用常规方法测定葡萄产量、品质、重金属含量及果园土壤中硝态氮、微生物量碳和氮、重金属含量,并对葡萄园土壤重金属累积达到限量所需年限进行推算。【结果】施用有机肥处理葡萄产量均显著高于单施化肥(NPK),其中以中量有机肥+化肥处理(M2NPK)的产量最高,4年(2010-2013)平均产量为21503kg/hm^2,较农民传统施肥(CK)提高了14%;施用有机肥处理葡萄Vc含量比对照显著增加。各处理间葡萄百粒重、pH、可溶性固形物、可滴定酸和固酸比差异不显著。收获后M2NPK处理0-20 cm和20-40 cm土壤硝态氮累积量下降,土壤微生物生物量碳、氮含量显著高于CK。连续4年施用有机肥后,葡萄果实及果园土壤的重金属含量(Cr、Cd、As、Pb、Hg、Cu、Zn)均未超标,但随着有机肥施用量的增加,葡萄及土壤中的重金属分别呈现线性和二次函数累积趋势。M3NPK处理土壤重金属含量较其他施用有机肥处理提前累积到限量水平。【结论】中量有机肥+化肥(M2NPK)处理葡萄的产量最高,品质最佳,而且降低了土壤硝态氮在各土层的累积,增加了土壤微生物生物量碳、氮含量,且葡萄果实和果园土壤重金属含量未超标。高量有机肥处理不会进一步提高红地球葡萄的产量和品质,但快速增加果园土壤重金属累积。     

小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究

  【目的】  钾离子通道 (potassium channel, PC) 蛋白通过介导离子跨膜转运，增强低钾胁迫下植株对钾素的吸收和利用能力。本研究以采用RNAseq鉴定小麦应答低钾基因获得的PC家族基因TaPC1为对象，对该基因分子特征、应答低钾表达模式及其介导植株抵御低钾逆境的能力进行研究。  【方法】  采用生物信息学工具分析TaPC1分子特征，采用溶液培养法培养丰钾 (K₂O 6 mmol/L )、低钾 (K₂O 0.06 mmol/L) 处理小麦和转化株系幼苗，采用 DNA 重组技术构建TaPC1亚细胞定位和表达质粒，利用农杆菌介导法遗传转化烟草。采用常规植株形态、生理和qPCR方法测定植株生长、生理指标和基因表达。  【结果】  TaPC1与植物种属PC家族基因具有较高的同源性，该基因编码蛋白具有植物种属PC蛋白跨膜域保守特征，翻译蛋白经内质网分选后定位于细胞质膜。低钾 (0.06 mmol/L) 处理下，根、叶中TaPC1表达增强；将低钾处理植株转入丰钾 (6 mmol/L) 营养液进行恢复处理后，根、叶中该基因表达下调，表明TaPC1呈低钾应答表达模式。基因遗传转化结果表明，与野生型 (WT) 对照相比，低钾处理下，超表达TaPC1烟草株系植株干物质积累量增多，细胞活性氧累积量减少，细胞保护酶 (SOD、CAT和POD) 活性提高，丙二醛含量降低。基因表达分析表明，低钾处理下，转化株系内细胞保护酶编码基因NtSOD1、NtCAT1;1、NtPOD1;2及NtPOD1;6的转录本丰度较野生型 (WT) 显著增多，表明上述基因通过增强表达，在改善转化株系低钾处理下细胞活性氧稳态中发挥重要作用。此外，与WT相比，低钾处理下转化株系的钾累积量显著增多，光合碳同化能力增强。  【结论】  TaPC1呈低钾胁迫增强表达模式，上调表达该基因能显著增强植株钾素吸收，有效维持低钾逆境下的细胞活性氧稳态特征，在改善植株光合物质生产和抵御低钾逆境能力中发挥重要作用。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

日本荚蒾ITS序列的克隆与分析

为日本荚蒾的分子鉴定及遗传多样性研究提供参考,在克隆日本荚蒾rDNA ITS全长的基础上,利用生物信息学手段明确其序列特征和系统发育关系。结果表明:日本荚蒾的ITS全长为617bp,ITS1、ITS2和5.8S序列长度分别为226bp、227bp和164bp;荚蒾属18种植物的ITS全长为607～617bp,其中ITS1为224～230bp,ITS2为219～227bp;ITS1和ITS2的变异位点各有86个和74个,其中信息位点分别为41个和29个;荚蒾属植物的平均遗传距离为0.062,日本荚蒾和宜昌荚蒾之间的遗传距离最小,在系统发育树上处于同一分支,支持率达99%。     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。